補腎活血湯抑制糖尿病腎病引起的足細胞損傷及EMT發(fā)生機制研究*

胡 維，熊 丹，黃 娟

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410007）

糖尿病腎?。―N）是糖尿病患者全身性微血管病變表現(xiàn)之一，也是糖尿病引發(fā)危害最大的一種慢性并發(fā)癥，亦是糖尿病患者死亡的主要原因之一[1]。糖尿病患者早期主要的臨床表現(xiàn)是尿蛋白，而蛋白尿是由足細胞損傷引起的[2]。有研究顯示，足細胞損傷的早期主要表現(xiàn)是足細胞通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生引起足細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引起蛋白尿[3]。Rac1在機體生理病理過程中發(fā)揮重要作用，如細胞增殖、黏附及細胞骨架調(diào)節(jié)等過程[4-5]。在糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的過程中炎癥反應及氧化應激與Rac1的激活異常密切相關(guān)[6]。Rac1是PAK1、p38MAPK等多條信號通路中發(fā)揮中樞紐帶作用。高糖誘導腎小管上皮細胞可通過激活p38MAPK信號通路誘發(fā)EMT[7]。補腎活血湯具有活血止痛、補腎壯筋的功效，在臨床上常用于治療糖尿病腎病。已有研究證實，補腎活血湯在糖尿病腎病中具有很多功能，如其可改善糖脂代謝，降低血脂水平等[8]，但其作用機制目前還缺乏深入研究。補腎活血湯在多種腫瘤中具有抑制EMT過程[9]，而其在糖尿病腎病中是否具有類似作用尚不明確，因此，本課題探究補腎活血湯在糖尿病腎病中改善足細胞損傷和減少EMT過程中發(fā)揮的作用并對其是否通過調(diào)控Rac1信號通路的分子機制進行研究。旨在深入研究補腎活血湯在糖尿病腎病中的作用機制，為臨床應用補腎活血湯進行糖尿病治療，解決目前糖尿病腎病缺乏特效治療手段等提供科學依據(jù)和轉(zhuǎn)化指導。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：永生化的小鼠足細胞系MPC5購于上海弘順生物科技有限公司。主要試劑：胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；噻唑藍（MTT）購于美國Sigma公司；Transwell小室購于美國Corning公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；底物電化學發(fā)光（ECL）試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購于上?；茖嶒炂鞑挠邢薰荆籊TP-Rac1抗體、p-PAK1抗體、p-p38抗體、p-β-catenin抗體、p65抗體及二抗均購于美國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組處理 體外培養(yǎng)永生化小鼠足細胞系MPC5，在I型膠原包被的培養(yǎng)瓶中，用RPMI 1640（含 10%FBS）+10 U/mL 重組小鼠 γ-干擾素，于33℃條件下培養(yǎng)足細胞，當融合度達到80%左右進行換液操作。用不含γ-干擾素培養(yǎng)基在37℃條件下，于含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d換液1次，約14 d左右可見足細胞胞核胞體均顯著增大，胞漿有分枝狀不規(guī)則突起，此時為足細胞分化成熟。成熟的足細胞分為以下幾組進行處理：對照組，使用含有5.6 mmol/L葡萄糖的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；高糖組（糖尿病腎病足細胞損傷模型組），在含有30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基中刺激48 h；補腎活血湯組，在含有30mmol/L葡萄糖、0.1mmol/L補腎活血湯的培養(yǎng)基中刺激48 h；NSC23766+高糖組，在含有30 mmol/L葡萄糖、10 μmol/L Rac1抑制劑NSC23766的培養(yǎng)基中刺激48 h；NSC23766+補腎活血湯組，在含有30 mmol/L葡萄糖、0.1 mmol/L補腎活血湯、10 μmol/L抑制劑NSC23766的培養(yǎng)基中刺激48h；PMA+高糖組，在含有30mmol/L葡萄糖、50 nmol/L激活劑 PMA的培養(yǎng)基中刺激48 h；PMA+補腎活血湯組在含有30 mmol/L葡萄糖、0.1 mmol/L補腎活血湯、50 nmol/L激活劑PMA的培養(yǎng)基中刺激48 h。

1.3 MTT法檢測各組足細胞增殖情況 對照組、高糖組、補腎活血湯組細胞按上所述處理48 h后，采用MTT法測定各組足細胞增殖情況。每孔中加入10 μL（濃度為10 mg/mL的MTT溶液，輕輕混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，取出細胞培養(yǎng)板，除去培養(yǎng)液，分別在每孔中加入150 μL二甲基亞砜溶液，混勻后置于震蕩儀上，低速震蕩反應10 min，于酶標儀490 nm處測定吸光度值（A值）。

1.4 流式細胞術(shù)檢測各組大腸癌細胞凋亡情況 將對照組、高糖組、補腎活血湯組細胞以前述條件下處理48 h后，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）潤洗1次，加入無乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶消化1～2 min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，以500 g離心5 min，以無菌預冷的PBS輕輕吹洗2次，并重懸制成密度為1×106/mL的單細胞懸液。將每組細胞懸液分別轉(zhuǎn)移至Falcon管，加入5 μL Annexin V-FITC及PI染料，置于避光處輕輕混合均勻，孵育15 min；各組 Falcon管中分別加入 400 μL binding buffer，1 h內(nèi)上機檢測，Annexin V-FITC陽性且PI陰性細胞為凋亡細胞，并統(tǒng)計各組足細胞的凋亡率。

1.5 Transwell實驗和劃痕實驗檢測各組足細胞遷移能力 Transwell實驗：在Transwell小室的上室加入200 μL無血清培養(yǎng)基，下室加入600 μL無血清培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中孵育2 h，將待檢測的對照組、高糖組、補腎活血湯組足細胞用0.25%的胰蛋白酶消化收集，用無血清培養(yǎng)基制備單細胞懸液。除去平衡后的Transwell小室無血清培養(yǎng)基，在Transwell下室加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基500 μL，上室加入200 μL細胞懸液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室，用棉簽拭去上室細胞及細胞碎片，用2 mL多聚甲醛固定10 min后加入500 μL結(jié)晶紫溶液進行染色，PBS清洗后，在倒置顯微鏡下觀察、拍照、計數(shù)穿膜細胞個數(shù)，以對照組為參照，計算相對遷移指數(shù)表示細胞遷移能力。

劃痕實驗：用記號筆在6孔板背后均勻劃橫線，大約每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。加入5×105/孔待測各組足細胞于6孔板中，以過夜能鋪滿孔板為宜，第2天用200 μL槍頭盡量垂直于6孔板背后橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜，用PBS洗滌細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。置于37℃含體積分數(shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24 h取樣拍照，測量各組細胞轉(zhuǎn)移的距離，以對照組為參照，計算相對遷移指數(shù)表示細胞遷移能力。

1.6 RT-PCR檢測 各組細胞采用Trizol法提取總核糖核酸（RNA），用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用SYBR Green PCR Master Mix進行熒光定量PCR，反應體系為20 μL，反應條件為：95 ℃，10 min 預變性；95 ℃，30 s，65 ℃，1 min，共40個循環(huán)。每個樣品設置3個復管，以β-actin為內(nèi)參，用相對定量 2-ΔΔCT進行分析。

1.7 Western blot檢測 各組細胞處理后培養(yǎng)48 h，收集各組細胞提取總蛋白，以BCA蛋白濃度檢測試劑盒測量提取蛋白濃度，將蛋白樣品與加樣緩沖液按體積比 4∶1混合后，95℃變性 10 min，加入 40 μg變性蛋白至聚丙烯酰胺凝膠電泳每個泳道孔中，在濃縮膠中采用80 V電壓，待溴酚藍進入到分離膠和濃縮膠邊緣時，調(diào)整電壓為130 V，電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF聚偏二氟乙烯膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用TBS緩沖液漂洗，將膜置于含5%的脫脂奶粉封閉液中封閉2 h。除去封閉液，分別加入含相應一抗進行雜交，4℃條件下過夜孵育，再用二抗進行雜交，室溫孵育2 h。轉(zhuǎn)移至暗室，以ECL化學發(fā)光試劑盒進行發(fā)光，以成像儀曝光后采用Image J圖像分析系統(tǒng)分析各條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，分析各組足細胞中待測蛋白的表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析 所得實驗數(shù)據(jù)均采用軟件SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 補腎活血湯改善高糖誘導的足細胞增殖抑制及凋亡 處理后48 h分別以MTT法和流式細胞術(shù)檢測各組足細胞增殖和凋亡情況，結(jié)果如表1所示，與對照組相比，高糖組細胞吸光度（A值）降低，凋亡率增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與高糖組相比，補腎活血湯+高糖組A值升高，凋亡率降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示高糖處理可抑制足細胞增殖，誘導細胞凋亡；補腎活血湯可改善高糖誘導的足細胞增殖抑制作用，減少高糖誘導的足細胞凋亡。說明補腎活血湯對高糖誘導的足細胞具有一定的保護作用。

表1 各組足細胞A值和凋亡率比較（x±s）

2.2 補腎活血湯減弱高糖誘導的足細胞遷移能力 各組足細胞處理48 h后以Transwell和劃痕實驗檢測各組足細胞體外遷移能力，結(jié)果如表2所示，與對照組相比，高糖組細胞遷移指數(shù)升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與高糖組相比，補腎活血湯組遷移指數(shù)降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示高糖處理可促進足細胞遷移能力，補腎活血湯可減弱高糖誘導的足細胞的遷移能力。

2.3 補腎活血湯減輕高糖誘導的細胞損傷和EMT的發(fā)生 各組足細胞處理48 h后以RT-PCR檢測各組足細胞及EMT發(fā)生過程標志指標的表達水平，結(jié)果如表3所示，與對照組相比，高糖組足細胞特異性指標P-cadherin、ZO-1 mRNA的表達水平均明顯降低，EMT發(fā)生過程標志 desmin、FSP-1 mRNA的表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與高糖組相比，補腎活血湯組足細胞P-cadherin、ZO-1 mRNA的表達水平明顯升高，desmin、FSP-1mRNA和蛋白的表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。足細胞特異性指標P-cadherin、ZO-1的表達減少提示高糖可誘導足細胞損傷，而補腎活血湯可減少高糖誘導的足細胞損傷；高糖組足細胞間充質(zhì)標志蛋白的高表達說明高糖誘導足細胞發(fā)生了EMT，而補腎活血湯可逆轉(zhuǎn)足細胞EMT的發(fā)生。

表2 各組足細胞遷移指數(shù)的比較（x±s）

表3 各組足細胞中P-cadherin、ZO-1、desmin、FSP-1 mRNA 的表達水平（x±s）

2.4 補腎活血湯對Rac1及其下游信號通路的影響 各組足細胞處理48 h后，以Western blot檢測各組足細胞中 GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、p-βcatenin、p65蛋白表達水平，結(jié)果如表4和圖1所示，與NSC23766+高糖組相比，NSC23766+補腎活血湯組足細胞中 GTP-GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、pβ-catenin、p65蛋白的表達水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與PMA+高糖組相比，PMA+補腎活血湯組足細胞中GTP-GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、p-β-catenin、p65 蛋白的表達水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明補腎活血湯可抑制Rac1及下游信號通路的激活。

3 討論

糖尿病腎病的發(fā)病機制和病因目前還不十分明確，但根據(jù)糖尿病腎病的病程和病理生理過程可發(fā)現(xiàn)，蛋白尿與糖尿病腎病進展關(guān)系密切[10]。研究表明，糖尿病腎病中足細胞的損傷是導致尿蛋白的主要原因之一[11]。高糖誘導足細胞中核內(nèi)活化T細胞核因子蛋白介導的過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α的表達下調(diào)引起足細胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導下抑制足細胞增殖，誘導足細胞凋亡，足細胞上皮標志P-cadherin、ZO-1表達量減少，間充質(zhì)標志desmin、FSP-1的表達顯著升高，提示引發(fā)足細胞發(fā)生EMT，且足細胞遷移能力增加。

表 4 各組足細胞中 GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、p-β-catenin、p65 蛋白表達水平（x±s）

圖1 Western blot檢測各組足細胞中GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、p-β-catenin、p65 蛋白的表達水平

補腎活血湯是治療糖尿病腎病常用的中藥藥劑，在糖尿病腎病治療中具有良好的治療效果，可明顯改善腎功能及血糖水平。近期研究顯示，糖尿病腎病患者以補腎活血湯治療后，患者病情發(fā)展得到有效控制，且尿蛋白排出量減少[13]。補腎活血湯對自發(fā)性高血壓所致大鼠心肌細胞損傷通過抑制心肌細胞凋亡，對心肌細胞具有一定的保護作用[14]。體外培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細胞，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的補腎活血湯，結(jié)果顯示補腎活血湯可抑制乳腺癌細胞生長和遷移，其作用機制是補腎活血湯與調(diào)控SDF-1/CXCR4信號通路活性有關(guān)[15]。本實驗結(jié)果顯示，補腎活血湯可緩解高糖誘導的細胞凋亡，提高足細胞增殖活性，減少高糖誘導的足細胞遷移，逆轉(zhuǎn)足細胞EMT的發(fā)生。

Rac1表達可通過與p21激活的激酶1（PAK1）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號傳導途徑相互作用改變細胞EMT[16]。PAK1、p38MAPK、βcatenin、p65作為Rac1下游重要的效應激酶和基因，這些激酶和基因的激活反應相應信號通路的激活。本實驗在高糖誘導的足細胞中加入Rac1抑制劑或激活劑后，GTP-Rac1、p-PAK1、p-p38、p-βcatenin、p65的表達水平均有不同程度的下調(diào)或上調(diào)，補腎活血湯處理后逆轉(zhuǎn)了這些蛋白的表達水平，說明補腎活血湯可調(diào)控Rac1及下游信號通路的活性。

綜上所述，足細胞在高糖誘導下發(fā)生凋亡、損傷及EMT，補腎活血湯可緩解高糖誘導的足細胞損傷，逆轉(zhuǎn)足細胞EMT的發(fā)生，其作用機制與補腎活血湯調(diào)控Rac1及下游信號通路的活性有關(guān)。為解決臨床應用活血補腎湯改善糖尿病患者腎損害提供實驗依據(jù)和理論基礎。