Fancm基因敲除小鼠構(gòu)建及其表型分析

楊橋，郭紅剛，樓琦，柯賢福，周文偉，應(yīng)華忠，俞冰，張婷婷*

(1. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州 310000； 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310000)

范可尼貧血(Fanconi Anemia, FA)又稱范可尼貧血綜合征，是一種較為少見的隱性遺傳疾病[1-2]。FA患者多伴有先天發(fā)育異常、進(jìn)行性骨髓衰竭與高度癌癥易感性[3-4]。近年來，范可尼貧血綜合征中的不孕不育表型也引起了廣泛關(guān)注[5-6]。范可尼貧血綜合征是由于范可尼貧血通路基因缺失造成的。至今為止，文獻(xiàn)中陸續(xù)報(bào)道了22個(gè)范可尼貧血通路基因(FANCAtoFANCV)，其中的任何一個(gè)發(fā)生突變，都會(huì)導(dǎo)致范可尼貧血癥的發(fā)生。范可尼貧血通路蛋白參與DNA交聯(lián)損傷修復(fù)(DNA interstrand crosslinks，ICLs)，維護(hù)基因組穩(wěn)定性與完整性[1,7]。范可尼貧血癥是研究DNA損傷修復(fù)通路在生長發(fā)育與腫瘤發(fā)生中功能的重要模型。

FANCM是范可尼貧血通路的核心蛋白之一，F(xiàn)ANCM識(shí)別并且結(jié)合到DNA交聯(lián)損傷的位點(diǎn)，募集并激活下游FANCD2-FANCI復(fù)合物，啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[8-9]。德國大學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)FANCM基因突變與家族早發(fā)性乳腺癌有顯著的相關(guān)性，是乳腺癌早期診斷與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的指標(biāo)[10]。多個(gè)國際醫(yī)學(xué)中心都報(bào)道了FANCM基因突變與三陰性乳腺癌以及卵巢癌的發(fā)病、藥物敏感性以及治療預(yù)后的相關(guān)性[11-15]。最近多個(gè)臨床研究證明了FANCM基因突變與遺傳性不孕不育的直接相關(guān)，多組男性家族性不育癥與非阻塞性無精癥患者的全基因組測(cè)序結(jié)果都發(fā)現(xiàn)了遺傳性FANCM基因變異[16-17]。法國學(xué)者還在一個(gè)有遺傳性卵巢早衰的芬蘭家族中發(fā)現(xiàn)FANCM基因突變是其致病因素[18]。

本課題組一直致力于范可尼貧血綜合征相關(guān)基因的研究，為了更好的理解FANCM突變?cè)斐傻纳韺W(xué)變化，特別是范可尼貧血綜合征相關(guān)的表型。我們使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Fancm基因敲除小鼠模型，希望借助此小鼠研究Fancm基因缺失對(duì)機(jī)體所產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2～4月齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠80只，體重20～30 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供【SCXK(滬)2017-0005】；2月齡，體重25～30 g，SPF級(jí)ICR小鼠5只，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(浙)2014-0001】；所有小鼠均飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境【SYXK(浙)2014-0008】。近交系繁育，溫度維持在22～25℃，濕度維持在50%～70%，晝夜明暗交替時(shí)間為12 h/12 h。所有操作均符合浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：2018-099)。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA體外轉(zhuǎn)錄與顯微注射

使用文獻(xiàn)[19-20]中方法Phusion高保真DNA聚合酶(NEB，美國)PCR快速合成sgRNA轉(zhuǎn)錄模板。使用MEGAshortscript轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion，美國)體外合成sgRNA，Megaclear純化試劑盒(Ambion，美國)純化sgRNA。選取3～4周齡雌性C57BL/6小鼠進(jìn)行超數(shù)排卵，每只注射10 IU血清促性腺激素(PMSG)，46～48 h后再注射10 IU絨膜促性腺激素(HCG)，24 h后解剖獲取卵母細(xì)胞，同時(shí)解剖獲取8周齡以上C57BL/6雄性小鼠精子，進(jìn)行體外受精，形成受精卵。利用顯微操作儀(Eppendorf，德國)將sgRNA/Cas9 mRNA混合樣本注射到受精卵胞質(zhì)中。注射后將受精卵置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，取狀態(tài)良好的受精卵移植到假孕ICR受體小鼠輸卵管內(nèi)，每只受體移植20～30枚受精卵。

1.2.2 基因型鑒定

剪取約3 mm小鼠尾尖組織，用DNA提取試劑盒(生工，中國)提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物FAM-F：TGGCGGGAGACTAATGGGCGT；FAM-R：CTATGTCCACAAGAGCCAGCCT。電泳分析并進(jìn)行測(cè)序鑒定。對(duì)Fancm-/-小鼠的體形大小、毛色、生長發(fā)育周期等進(jìn)行觀察分析[21]。

1.2.3 蛋白免疫印跡鑒定FANCM蛋白表達(dá)

取Fancm-/-小鼠與同窩野生型小鼠，脫頸椎猝死解剖獲取其睪丸組織，在含有蛋白酶抑制劑裂解液中勻漿提取總蛋白，經(jīng)6% SDS-PAGE凝膠電泳分離，70 V恒壓濕轉(zhuǎn)2.5 h。經(jīng)Anti-FANCM(Abcam，英國)抗體4℃孵育過夜，TBST洗3次，羊抗兔二抗室溫孵育2 h，TBST洗2次，經(jīng)ECL顯影液在化學(xué)發(fā)光儀中顯影成像。

1.2.4 血常規(guī)檢測(cè)

Fancm-/-小鼠與同窩野生型小鼠，戊巴比妥鈉麻醉進(jìn)行眼眶取血約100 μL，使用全自動(dòng)血液分析儀(Celltace，日本)分析。

1.2.5 H&E染色、IHC免疫組化、TUNEL實(shí)驗(yàn)方法

取Fancm-/-小鼠與同窩野生型小鼠，脫頸椎猝死解剖獲取其睪丸組織，用4%多聚甲醛溶液過夜固定，組織包埋切片，進(jìn)行蘇木素伊紅(H&E)染色、PCNA免疫組化染色、TUNEL染色，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表達(dá)為mean ± SEM，Microsoft Excel 軟件進(jìn)行卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)(χ2.TEST)，顯著性差異表示為*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。

注：A：sgRNA 體外合成與電泳鑒定。B：PCR鑒定F0代嵌合子小鼠，M為Marker DL500。C：選擇的F0代小鼠與野生型C57BL/6交配，PCR鑒定F1代雜合子Fancm+/-小鼠，M為Marker DL2000。D：圖C中PCR產(chǎn)物測(cè)序后，分析F1代小鼠sgRNA靶點(diǎn)敲除序列?！?#bp)”為省略基因編碼數(shù)，“-”為缺失編碼，Exon1、E2、E3分別為外顯子1、2、3。E：PCR基因鑒定同窩野生型、雜合Fancm+/-小鼠、純合Fancm-/-小鼠。WT：野生型Wild type；HET：雜合Heterozygote；KO：敲除Knockout;M為Marker DL500。圖1 Fancm基因敲除小鼠的構(gòu)建與基因鑒定Note. A, In vitro synthesis and electrophoresis identification of sgRNA. B, Identification of F0 chimera mice by PCR. M, Marker DL500. C, Selected F0 chimera mice are mated with wild type C57BL/6 mice. The F1 heterozygous mice is identified by PCR. M, Marker DL2000. D, After sequencing the PCR products in Figure C, the sgRNA target knockout sequences of F1 mice are analyzed. “(#bp)” marks the region omitted. “-” marks the deleted sequence. E2, E3 are exon2 and exon3. E, Genotyping of Wild type, heterozygote Fancm+/- mice and homozygote Fancm+/- mice from the same littermates are identified by PCR. M, Marker DL500.Figure 1 Establishment and identification of the Fancm knockout mice

2 結(jié)果

2.1 基因敲除小鼠品系的建立及基因型鑒定

針對(duì)小鼠Fancm基因序列蛋白編碼區(qū)第1個(gè)外顯子中的ATG區(qū)域，使用http://crispr.mit.edu/網(wǎng)站工具設(shè)計(jì)3個(gè)sgRNA(sg-1：AGAACGCTCTTCC AGACGTG；sg-2：TGGCGGCGTACGAGGCTGAG；sg-3：ACTGTGGAATACCCATCACG)。根據(jù)設(shè)計(jì)的sgRNA序列，PCR合成轉(zhuǎn)錄模板，MEGAshortscript 轉(zhuǎn)錄試劑盒體外合成sgRNA，MEGAclear試劑盒純化，以低分子量ssRNA ladder(NEB，美國)為參照，進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示120 bp處一條單一的sgRNA條帶(圖1A)，Nanodrop檢測(cè)A260/280約2.0，A260/230約2.1，濃度在2000 ng/μL左右，-80℃保存。使用前，混合Cas9 mRNA(吉熒生物，中國)100 ng/μL和每種sgRNA各40 ng/μL。

約55個(gè)顯微注射后狀態(tài)較好的受精卵，移植到2只假孕ICR小鼠中，共出生9只F0代小鼠。進(jìn)行PCR鑒定與TA克隆測(cè)序分析(圖1B)，F(xiàn)0代小鼠中，#5為野生型序列，#8為純合21 bp缺失，#1、#2、#3、#6、#9、#10為測(cè)序雙峰，敲除效率可達(dá)80%以上。選擇有大片段缺失的#1、#3、#9作為F0代首建鼠與野生型C57BL/6進(jìn)行交配，對(duì)F1代小鼠進(jìn)行PCR鑒定及測(cè)序(圖1C)，確定三種基因型突變(圖1D)，分別為line A (-89 bp & 278 bp)、line B (-75 bp & 278 bp)、line C (-405 bp)，其中Line A與B中89 bp與75 bp的敲除均包含F(xiàn)ancm基因ATG起始密碼子區(qū)域，Line C中的405 bp敲除，在Fancm基因CDS1中，無法造成移碼突變。最終保留line A (-89 bp & 278 bp)進(jìn)行繁育互交。對(duì)F2代小鼠進(jìn)行PCR(圖1E)鑒定，野生型為615 bp條帶，純合Fancm-/-小鼠為248 bp條帶，雜合Fancm+/-小鼠為615/248 bp兩條條帶。

2.2 Western blot檢測(cè)野生型與Fancm-/-小鼠睪丸組織中FANCM蛋白表達(dá)情況

范可尼貧血家族基因在小鼠生殖器官，特別是睪丸中有高水平表達(dá)[22-23]。提取8～10周齡Fancm-/-及同窩野生型小鼠睪丸組織總蛋白，使用anti-FANCM抗體(ab95014，Abcam)進(jìn)行Western blot分析。FANCM蛋白大小為227×103左右，野生型小鼠睪丸組織中有顯著性表達(dá)，在Fancm-/-小鼠睪丸組織中無表達(dá)，證明Fancm基因已經(jīng)被完全敲除(圖2)。GAPDH為內(nèi)參蛋白。

圖2 Western Blot檢測(cè)野生型與Fancm-/-小鼠睪丸組織中FANCM蛋白表達(dá)Figure 2 Detection of FANCM protein expression in the wild type and Fancm-/- mouse testis by Western blot

注：A：同窩8周齡Wild type與Fancm-/-小鼠體重比較，n≥ 5。B：Fancm+/-互交繁育，子代Fancm-/-小鼠數(shù)目觀察值與預(yù)期值比較，卡方檢驗(yàn)(χ2.TEST)分析顯著性。C：雌雄Fancm-/-小鼠比例觀察值與預(yù)期值比較，卡方檢驗(yàn)(χ2.TEST)分析顯著性。圖3 Fancm-/-小鼠表型分析Note. A, Comparison of body weight between 8-week-old wild type and Fancm-/- mice in the same litter. n≥ 5. B, Fancm+/- mice were mated with each other, and the observed number and expected number of offspring Fancm-/- mice are compared. χ2.TEST for statistical analysis. C: The observed versus the expected numbers of male and female Fancm-/- mice. χ2.TEST is used to analyze the statistical significance.Figure 3 Phenotypic analysis of the Fancm-/- mice

2.3 Fancm-/-小鼠繁育與觀察

小鼠飼養(yǎng)于SPF屏障環(huán)境中，將8～10周的雄性與雌性Fancm+/-小鼠進(jìn)行交配。觀察發(fā)現(xiàn)Fancm+/-小鼠的繁育周期、產(chǎn)仔胎數(shù)、每胎產(chǎn)仔數(shù)與野生型并無明顯區(qū)別(數(shù)據(jù)未列出)。6周左右的Fancm-/-小鼠與同窩的野生型小鼠比較，體重、外形并無明顯區(qū)別(圖3A)，解剖后觀察主要臟器脾、肝、肺、腎、腦等組織正常(數(shù)據(jù)未列出)。雌雄Fancm+/-小鼠交配后子代小鼠中Fancm-/-小鼠的比例為19.6%，低于預(yù)期的25%，但卡方檢驗(yàn)(χ2.TEST)分析無顯著性，說明Fancm基因缺失沒有導(dǎo)致明顯的胚胎致死性(圖3B)。但是雌性Fancm-/-小鼠的數(shù)目顯著低于雄性Fancm-/-小鼠，具體原因不明(圖3C)。雄性與雌性Fancm-/-相互交配，分別與野生型小鼠交配都有不育表型(數(shù)據(jù)未列出)。

2.4 Fancm-/-小鼠的血常規(guī)分析

血常規(guī)分析發(fā)現(xiàn)8周左右Fancm-/-小鼠與同窩的野生型小鼠比較，F(xiàn)ancm-/-小鼠血紅蛋白濃度(HGB)有顯著性升高，白細(xì)胞數(shù)(WBC)有明顯升高但是未達(dá)到顯著性(P=0.0553)。紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)與野生型小鼠無明顯區(qū)別(圖4)。

注：同窩8周齡Wild type與Fancm-/-小鼠血常規(guī)分析，n ≥ 5?！癗S”, 無顯著性差異。圖4 Fancm-/-小鼠血常規(guī)分析Note. The blood routine of 8-week-old wild type and Fancm-/- mice in the same littermates is analyzed. n ≥ 5. “NS”, Not significant.Figure 4 Blood routine analysis of Fancm-/- mice

2.5 Fancm-/-小鼠睪丸發(fā)育的組織病理學(xué)分析

多個(gè)范可尼貧血通路基因敲除的小鼠都有生殖器官發(fā)育缺陷與生殖能力降低的表型[23-24]。雄性與雌性Fancm-/-小鼠相互交配，分別與野生型小鼠交配都有不育表型(數(shù)據(jù)未列出)。解剖8周左右的同窩野生型與Fancm-/-雄性小鼠發(fā)現(xiàn)Fancm-/-小鼠睪丸體積明顯較小(圖5A)，睪丸與體重比與野生型雄性小鼠比較顯著性降低(圖5B)。將睪丸組織固定后切片進(jìn)行H&E染色發(fā)現(xiàn)野生型小鼠的生精小管具有正常的組織結(jié)構(gòu)和完全的生殖細(xì)胞分布(圖5C)，而Fancm-/-小鼠的生精小管發(fā)育退化，具有嚴(yán)重異質(zhì)性(圖5D)。根據(jù)文獻(xiàn)[16-17]描述方法把小鼠睪丸H&E染色切片中顯示的異質(zhì)性生精小管的典型圖像分為4類(圖5E)：①組織形態(tài)相對(duì)正常的生精小管(relatively normal tubules，RN)，②只有精母細(xì)胞和精子細(xì)胞，但是沒有成熟的精子生成的生精小管(round spermatid arrest, RSA)，③只有睪丸支持細(xì)胞與少量的生殖細(xì)胞的生精小管(degenerated tubules with massive germ，cell loss, GCL)，④生精小管只有空泡狀的睪丸支持細(xì)胞完全沒有生殖細(xì)胞(Sertoli cell-only tubules，SCO)。在顯微鏡下分別觀察181個(gè)野生型小鼠生精小管和148個(gè)Fancm-/-小鼠生精小管，根據(jù)每個(gè)生精小管橫切面的不同形態(tài)，將其歸列為以上4類生精小管中的一類。統(tǒng)計(jì)分析野生型小鼠與Fancm-/-小鼠中，每一類生精小管占所有生精小管的百分比。結(jié)果顯示(圖5F)在野生型小鼠中RN型生精小管占42%，而41%為RSA型，17%為GCL型，沒有SCO型生精小管。在Fancm-/-小鼠睪丸中RN和RSA型共計(jì)只有3%，54%為GCL型，43%的生精小管為SCO型。這些結(jié)果證明FANCM蛋白缺失嚴(yán)重影響小鼠睪丸的正常發(fā)育。

注：A：同窩8周齡野生型Wild type、純合子Fancm-/-小鼠睪丸形態(tài)比較，比例尺=5 mm。B：同窩8周齡野生型Wild type、純合子Fancm-/-小鼠睪丸與體重比例統(tǒng)計(jì)分析，(n=3，***P< 0.001)。C、D：同窩8周齡野生型Wild type(C)、純合子Fancm-/-小鼠(D)睪丸切片H&E染色?！?00；比例尺=100 μm。E：不同類型生精小管H&E染色圖：① 組織形態(tài)相對(duì)正常的生精小管(RN)，② 有的只有精母細(xì)胞和精子細(xì)胞，但是沒有成熟的精子生成(RSA)，③ 有的只有睪丸支持細(xì)胞與少量的生殖細(xì)胞(GCL)，④ 有的生精小管只有空泡狀的睪丸支持細(xì)胞完全沒有生殖細(xì)胞(SCO)；S：間質(zhì)，BM：基底膜，SC：支持細(xì)胞，SG：精原細(xì)胞，SS次級(jí)精母細(xì)胞，ST：精子細(xì)胞，SZ：精子；×200，比例尺=50 μm；×400，比例尺=20 μm。F：按照?qǐng)DE中的類型分類，統(tǒng)計(jì)圖C Wild type、圖D Fancm-/-中不同類型的生精小管占比。圖5 Fancm-/-小鼠睪丸的組織病理學(xué)分析Note. A. Comparison of testicular morphology between 8-week-old wild type and homozygous Fancm-/- mice in the same litter. Scale bar=5 mm. B. Statistical analysis of testis/body weight ratio of 8-week-old wild type and Fancm-/- mice in the same litter. n=3,***P< 0.001. C, D. Histology (HE staining) of testicular tissues of 8-week-old wild type (C) and Fancm-/- mice (D) in the same litter. E: Representative images of H&E stained testicular sections showing various seminiferous tubules in adult Fancm-/- mice. ① SCO: Sertoli cell-only tubules, ② GCL: degenerated tubules with massive germ cell loss, ③ RSA: tubules with round spermatids as their most advanced spermatogenic cells (round spermatid arrest, RSA), ④ RN: relatively normal tubules. S: stroma, BM: basement membrane, SC: supporting cells, SG: spermatogonia, SS: secondary spermatocytes, ST: sperm cells, SZ: sperm. F: Quantification of different types of seminiferous tubules in Wild type (C) and Fancm-/- (D) mice based on the seminiferous tubule description in (E).Figure 5 Histopathological analysis of the Fancm-/- mouse testes

由于FA通路蛋白的DNA損傷修復(fù)功能在調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞有絲分裂減數(shù)分裂進(jìn)程中有重要作用[25]。我們進(jìn)一步對(duì)Wild type與Fancm-/-小鼠睪丸組織切片進(jìn)行細(xì)胞周期標(biāo)記物PCNA免疫染色與細(xì)胞凋亡標(biāo)記物TUNEL檢測(cè)。PCNA免疫染色結(jié)果顯示W(wǎng)ild type小鼠睪丸組織中，幾乎100%的生精小管中都有大量的PCNA染色陽性細(xì)胞，并且均勻分布在生精小管內(nèi)部邊緣(圖6A)。而Fancm-/-小鼠睪丸中只有少數(shù)結(jié)構(gòu)較為完整的生精小管中有PCNA陽性細(xì)胞，但細(xì)胞數(shù)目很少，且呈現(xiàn)不規(guī)律分布(圖6B)。對(duì)Wild type小鼠(圖6A)與Fancm-/-小鼠(圖6B)睪丸組織PCNA染色切片，在顯微鏡下分別觀察多個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中有PCNA陽性細(xì)胞的生精小管數(shù)目，計(jì)算PCNA陽性、陰性生精小管百分比并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。Wild type小鼠中100%的生精小管都有正常的PCNA陽性細(xì)胞，而Fancm-/-小鼠中，只有24.5%的生精小管有PCNA陽性細(xì)胞，而76.5%的生精小管均無PCNA陽性細(xì)胞(圖6C)。TUNEL染色結(jié)果顯示部分Fancm-/-小鼠睪丸生精小管中(圖6E)有大量TUNEL陽性細(xì)胞。在顯微鏡下分別觀察圖6D、6E中多個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中每個(gè)生精小管中TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)目，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。Wild type小鼠中有5個(gè)以上的TUNEL陽性細(xì)胞的生精小管數(shù)目占比只有1.2%，而Fancm-/-中有10.8%。Wild type小鼠中有1～4個(gè)TUNEL陽性細(xì)胞的生精小管數(shù)目占比11.2%，F(xiàn)ancm-/-中只有6.5%。綜上所述，F(xiàn)ancm-/-小鼠睪丸精子發(fā)育過程中，生精細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致Fancm-/-小鼠睪丸發(fā)育缺陷。

注：A、B：野生型與 Fancm-/- 小鼠睪丸切片PCNA染色。細(xì)胞核為藍(lán)色，PCNA陽性細(xì)胞為棕黃色；上圖：×100，比例尺=100 μm；下圖：×200，比例尺=50 μm。C：野生型Wild type、純合子Fancm-/-小鼠睪丸生精小管中有PCNA陽性細(xì)胞的生精小管比例統(tǒng)計(jì)(n=4)(***P< 0.001)。D、E：野生型與 Fancm-/- 小鼠睪丸切片TUNEL染色。細(xì)胞核為DAPI藍(lán)色，TUNEL陽性細(xì)胞為FITC綠色；×200，比例尺=50 μm。F：野生型Wild type、純合子Fancm-/-小鼠睪丸生精小管中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目的分布統(tǒng)計(jì)(n=6)(*** P<0.001)。圖6 野生型與 Fancm-/- 小鼠睪丸切片PCNA染色與細(xì)胞凋亡TUNEL分析Note. A, B: Testicular tissues of 8-week-old wild type (A) and Fancm-/- (B) mice. PCNA immunochemistry staining. The nuclei were blue-stained, and the PCNA-positive cells were brownish yellow. C: Percentage of seminiferous tubules with PCNA-positive cells in wild type (A) and Fancm-/- (B) mice.(n=4，***P< 0.001). D, E: Testicular tissues of 8-week-old wild type (D) and Fancm-/- (E) mice. TUNEL staining. The nuclei are blue, and the TUNEL-positive cells are FITC-green. Upper: TUNEL staining, Lower: TUNEL staining merged with DAPI staining. F: Percentage of seminiferous tubules with TUNEL-positive cells in wild type (D) and Fancm-/- (E) mice.(n=6，***P< 0.001).Figure 6 Comparison of the apoptosis in the testicular tissues of wild type and Fancm-/- mice(Immunohistochemical PCNC staining)

3 討論

本研究使用CRISPR/Cas9技術(shù)[26]直接在Fancm基因ATG區(qū)域設(shè)計(jì)sgRNA，靶向敲除ATG序列，完全終止Fancm基因的轉(zhuǎn)錄翻譯起始[27]。Fancm-/-小鼠中FANCM蛋白表達(dá)完全消失。Fancm-/-小鼠的出生率、體重、形態(tài)與同窩野生型小鼠比較無明顯差異。雌雄Fancm-/-小鼠都有不育癥表型，組織形態(tài)學(xué)研究表明Fancm-/-小鼠睪丸中大部分的生精小管發(fā)育嚴(yán)重退化。免疫組化與TUNEL實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ancm-/-小鼠生精小管中細(xì)胞周期標(biāo)志PCNA染色陽性細(xì)胞顯著減少而凋亡信號(hào)標(biāo)記TUNEL陽性細(xì)胞顯著增加，說明Fancm在小鼠睪丸發(fā)育、精子生成中具有重要作用。Fancm全基因敲除小鼠將是全面精確研究Fancm基因在機(jī)體發(fā)育中生理功能的重要工具。

本研究的Fancm-/-小鼠與文獻(xiàn)報(bào)道中Fancm點(diǎn)突變小鼠相比睪丸退化程度更加嚴(yán)重，生精小管病變也更加顯著[17]，我們推測(cè)由于Fancm點(diǎn)突變小鼠中的FANCM蛋白編碼在突變位點(diǎn)后面附近終止，并沒有完全缺失，剩余截?cái)嗟腇ANCM蛋白還具有部分功能，能夠在一定程度上緩解生殖器官發(fā)育缺陷的表型。人源FANCM蛋白共有2048個(gè)氨基酸，蛋白的N端為ATP結(jié)合區(qū)，中間部分為MHF蛋白結(jié)合區(qū)，C端為FAAP24蛋白結(jié)合區(qū)。全基因測(cè)序分析顯示，每個(gè)FANCM基因突變患者的突變位點(diǎn)都不同，剩余截?cái)嗟腇ANCM蛋白保留了大小不同的MHF結(jié)合區(qū)與FAAP24結(jié)合區(qū)[16,28-29]。剩余截?cái)郌ANCM蛋白片段根據(jù)大小的不同，具有不同的FANCM蛋白的部分功能，這可能是FANCM突變患者生殖器官病變程度臨床癥狀差異明顯的直接原因[16]。

FANCM蛋白不僅與其他FA通路蛋白協(xié)同參與DNA交聯(lián)損傷修復(fù)，還具有FA通路以外的獨(dú)立功能與作用[9]。FANCM蛋白復(fù)合物在識(shí)別并結(jié)合到DNA損傷位點(diǎn)后，不僅可以激活FA通路，還參與ATR通路信號(hào)傳導(dǎo)、端粒序列復(fù)制、DNA穩(wěn)定性維護(hù)等功能[30-31]。據(jù)報(bào)道FANCM突變的患者癥狀與其他FA通路基因突變患者癥狀有明顯差異。FANCM突變患者貧血與骨髓衰竭的表型不明顯，但是生殖缺陷與腫瘤高發(fā)的表現(xiàn)出非常突出[29]。Fancm-/-小鼠存在生殖器官發(fā)育缺陷的表型與多個(gè)經(jīng)典的FA基因如Fanca、Fancd2基因敲除小鼠的表型非常相似[24]，證明Fancm基因與其他FA通路基因功能相似。但是Fancm小鼠與其他FA小鼠在生殖缺陷的嚴(yán)重程度，骨髓衰竭、急性髓系白血病的發(fā)生、腫瘤發(fā)病率等方面的差異還有待后續(xù)的細(xì)致研究。使用Fancm小鼠模型研究Fancm基因缺失造成的生理病理表型，并與其他范可尼貧血小鼠表型比較，其研究結(jié)果將對(duì)FANCM突變患者的早期臨床診斷、基因型表型鑒定以及后續(xù)的治療等提供巨大的幫助。