豬圓環(huán)病毒3型感染BALB/c小鼠的實驗觀察

張超林，劉攀，沈萌，王妍，王娟，顏世君，嚴權斌，鄧均華，孫哲，郭小參，王同燕，李向東*，田克恭,*

(1. 國家獸用藥品工程技術研究中心，河南洛陽 471003； 2. 普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽 471000;3.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 410005)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)是單股閉合環(huán)狀無囊膜的DNA 病毒，屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)，病毒粒子直徑平均為17 nm，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小動物病毒之一[1]。目前根據(jù)豬圓環(huán)病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差異，將其劃分為豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)[2]。PCV1最早在PK-15細胞中被發(fā)現(xiàn)，該病毒在細胞上不產(chǎn)生病變，也不會引起豬的發(fā)病，通常被認為是一種無致病性的細胞污染物，基因組全長1759 bp；PCV2可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，同時還與母豬繁殖障礙、豬皮炎與腎病綜合征、豬壞死性及增生性肺炎等疾病密切相關，具有較強的致病性，基因組全長1768 bp或1767 bp[1-2]；PCV3最早于2016年，由Palinski等[3]在美國某商品化豬場發(fā)現(xiàn)并報道，PCV3基因組全長2000 bp，基因結構與PCV相似，同樣包含3個主要開放閱讀框。與 PCV3相關的疾病包括豬皮炎與腎病綜合征、呼吸道疾病綜合征，母豬繁殖障礙，仔豬心臟和多系統(tǒng)炎癥、腹瀉、先天性震顫等，而且在各個年齡階段以及無明顯臨床發(fā)病癥狀的豬中均能檢測到PCV3的存在，這就給臨床確診提高了難度，對疾病的預防和控制帶來困難[3-13]。

豬對PCV2具有較強的易感性，該病毒可以水平傳播，也可以垂直傳播，目前世界各地規(guī)?；i場普遍存在PCV2感染，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成的巨大的經(jīng)濟損失[2]。自2016年美國報道PCV3以來，隨后在中國、韓國、波蘭、英國、意大利、丹麥、西班牙、巴西、瑞典和泰國等地陸續(xù)都報道存在該病[4-13]。目前對該病的研究還處于起始階段，針對PCV3的預防和控制還處于探索階段。目前，已有研究顯示在中國的犬類中檢測出PCV3陽性感染，而在鴨類中未檢出PCV3[2,14]。對于鼠類是否感染PCV3尚未有報道，為了了解PCV3對小鼠的感染情況，本研究以臨床檢測為PCV3陽性的豬肺臟組織樣品制備PCV3組織毒，將其感染BALB/c小鼠，觀察其臨床癥狀、剖檢和病理變化，并通過血清學檢測、熒光定量PCR檢測和測序分析等方法分析PCV3感染情況，以期為PCV3的預防和控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級4～6周齡BALB/c雌性小鼠10只，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(京)2016-0011】。飼養(yǎng)于普萊柯生物工程股份有限公司【SYXK(豫)2013-0003】P2實驗室+飼養(yǎng)間小型SPF實驗動物設施IVC系統(tǒng)，所有小鼠均在已消毒的動物室中隔離飼養(yǎng)，采取自由飲水和采食。小鼠飼料購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司。所有操作均符合實驗動物倫理學要求【倫理審批號：AEEI-2018-031】。

1.1.2 PCV3陽性組織

豬源PCV3陽性組織由國家獸用藥品工程技術研究中心保存。

1.1.3 主要試劑

Viral Nucleic Acid Extraction Kit購自中國Geneaid公司；熒光定量PCR試劑Probe qPCR Mix和高保真DNA 聚合酶 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 均購自日本TaKaRa公司；DNA 凝膠回收試劑盒購自美國Omega；2×Taq PCR MasterMix購自中國天根生化科技(北京)有限公司；TransScript II Reverse Transcriptase [M-MLV, RNaseH-](High Temperature RT)，Ribonuclease Inhibitor 和pEASY-Blunt Cloning Kit均購自中國北京全式金生物技術有限公司；胰蛋白胨(Tryptone)和酵母浸出液(Yeast Extract)均購自英國 Oxoid公司；HRP標記的羊抗鼠單抗購自美國Sigma Aldrich，PCV3 Cap蛋白由國家獸用藥品工程技術研究中心制備和純化，其他試劑為國產(chǎn)試劑。

1.1.4 主要儀器

熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；酶標儀購自美國Biotek公司；Mini臺式離心機購自德國Eppendorf公司；PCR儀購自美國ABI公司；紫外透射分析儀購自其林貝爾公司；瓊脂糖凝膠電泳儀購自美國Hoefer公司；紫外成像儀購自美國UVP公司；恒溫培養(yǎng)箱購自德國MMM公司；循環(huán)水浴鍋購自英國Prima公司；旋渦混合器購自美國Scientific Industries Inc；全封閉式組織脫水機、組織包埋機、半自動輪轉切片機和攤片烤片一體機均購自美國Leica公司；空氣浴震蕩搖床購自美國NBS公司；恒溫水浴鍋購自中國上海一恒公司。

1.1.5 引物設計

參考文獻中所述[15]，合成檢測rep基因和CAP基因的引物，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，其序列如表1所示。

表1 檢測用引物序列Table 1 Sequences of the primers used for detection

1.2 方法

1.2.1 PCV3組織毒的制備

選擇PCV3陽性組織樣品，稱重后使用研磨器進行研磨，以1 g∶10 mL的比例加入滅菌PBS溶液，混勻后于-80℃凍融3次，經(jīng)4℃、5000 g、10 min離心，收集上清，4℃、10 000 g、10 min離心，收集上清經(jīng)0.22 μm濾器過濾分裝，取樣用Viral Nucleic Acid Extraction Kit制備核酸，使用TransScript II Reverse Transcriptase [M-MLV, RNaseH-](High Temperature RT)，Ribonuclease Inhibitor 和2× Taq PCR MasterMix進行外源病毒PCR或RT-PCR檢測(包括豬圓環(huán)病毒Ⅰ型、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細小病毒、豬瘟病毒、乙腦病毒等)，外源病毒檢測陰性的組織樣品，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 感染及試驗設計

將10只BALB/c小鼠隨機分為兩組，實驗組小鼠分別以0.1 mL/只滴鼻和0.5 mL/只腹腔注射感染PCV3組織毒(2.4×106拷貝)，對照組小鼠接種同樣劑量的PBS溶液。兩組小鼠分別飼養(yǎng)，均自由采食和飲水，感染開始前的時刻記為0 d，分別于感染后第0、3、7、11、14天經(jīng)尾靜脈采血。于感染后14 d對小鼠實施安樂死，剖檢并采集組織樣品。若實驗中小鼠死亡，則立即剖檢并采集組織樣品。

1.2.3 臨床癥狀、剖檢病變及病理組織學觀察

感染后每天早晚各觀察一次，觀察小鼠的臨床癥狀。感染14 d后解剖小鼠并記錄各組織器官的眼觀病變。取心臟、肝、脾、肺、腎、腦和淋巴結組織， 4% 甲醛溶液固定，常規(guī)制備石蠟切片，HE染色，光鏡觀察組織病變。

1.2.4 血清及各組織含毒量檢測

小鼠血清，以50 μL/樣制備檢測樣品；觀察組織病變情況，選擇病變交界處稱取0.2 g，放入研磨器中研磨，加入2 mL滅菌PBS，按照組織毒的制備方法制備樣品，按照Viral Nucleic Acid Extraction Kit核酸提取試劑盒的說明書提取核酸。參考文獻中PCV3熒光定量PCR檢測方法[15]，使用REP基因檢測引物擴增目的基因，構建標準質粒，建立標準曲線。按照Probe qPCR Mix試劑和BIO-RAD熒光定量PCR儀要求進行操作，反應條件：95℃，1 min；95℃ 5 s，60℃ 35 s，40個循環(huán)，每個樣品均進行三次重復檢測。

1.2.5 陽性組織樣品的測序分析

根據(jù)BALB/c小鼠各組織樣品RT-QPCR檢測結果，選擇陽性樣品核酸，使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase、CAP基因測序引物進行擴展，膠回收PCR產(chǎn)物，將其克隆至pEASY-Blunt載體，選擇陽性克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司測序，使用DNAStar軟件分析感染小鼠后病毒核酸序列是否發(fā)生變化。

1.2.6 血清抗體檢測

使用PCV3 CAP蛋白包被96孔板，采用間接ELISA法對小鼠血清樣品進行檢測[16]，具體操作參考文獻中所述，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Graphpad Prism5統(tǒng)計軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，用獨立樣本t檢驗比較感染組組與對照組間的差異，若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布， 則用非參數(shù)檢驗。統(tǒng)計軟件采用 SPSS 16.0，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。

2 結果

2.1 臨床癥狀及剖檢病變

實驗過程中對照組未觀察到任何臨床變化，被毛光澤，反應靈敏，飲食、飲水和活動均正常。感染組在感染后第3天有輕微精神沉郁，個別小鼠表現(xiàn)為不愿走動，其他未見有明顯癥狀。剖檢觀察對照組和實驗組小鼠組織器官基本正常，未看到明顯變化。

2.2 病理組織學變化

組織病理檢測結果顯示對照組5只小鼠各組織器官未見明顯病變。個別感染組小鼠在肺臟局部看見肺泡隔輕微增厚，肺泡上皮細胞增生(見圖1A)；局部肺小葉邊緣肺泡壁血管擴張淤血(見圖1B)；淋巴結巨噬細胞內(nèi)可見吞噬有少量崩解壞死的淋巴細胞碎片(見圖1C)，其他組織無明顯變化。

2.3 血清和各組織病毒含量檢測結果

根據(jù)檢測方法判斷標準，以Ct值>36判為陰性，血清樣品檢測結果說明，PCV3感染小鼠3 d血清樣品檢測為陽性，1只小鼠7 d血清樣品檢測為陰性，11、14 d樣品檢測為陰性(表2)。各組織中病毒含量檢測結果如表3所示，感染后14 d小鼠的心臟、肝、脾、肺、腎、腦和淋巴結組織均能檢測到病毒，其中以肝的病毒含量最高，其次為脾，其他組織中病毒含量較低。

分組Groups 編號Numbers0 d3 d7 d11 d14 d病毒感染組 Infected group1#-33.77 ± 0.2135.58 ± 0.3138.22 ± 0.2638.22 ± 0.262#-34.49 ± 0.2535.67 ± 0.3138.02 ± 0.3038.02 ± 0.303#-34.59 ± 0.2536.71 ± 0.2538.99 ± 0.2538.99 ± 0.154#-33.94 ± 0.2033.67 ± 0.3636.17 ± 0.3636.47 ± 0.325#-33.57 ± 0.2034.70 ± 0.3135.94 ± 0.3137.07 ± 0.15空白對照組 Control group6#-----7#-----8#-----9#-----10#-----

表3 BALB/c小鼠感染PCV3后各臟器熒光定量PCR檢測結果Table 3 Results of quantitative fluorescence RT-PCR detection of PCV3 in different organs of BALB/c mice after PCV3

2.4 BALB/c小鼠PCV3陽性組織樣品克隆測序

選擇肝和脾核酸樣品，分別擴增PCV3 CAP基因，對其進行測序分析，結果圖2所示，在小鼠肝和脾中的PCV3 序列與豬組織中PCV3序列相同，未發(fā)生變化。

注：PCV3-Porcine-ORF2，豬組織樣品中PCV3 CAP序列；PCV3-Mice Liver ORF2，感染小鼠肝中PCV3 CAP序列；PCV3-mice spleen ORF2，感染小鼠脾中PCV3 CAP序列。圖2 PCV3 CAP基因序列分析Note. PCV3-Porcine-ORF2: The sequence of PCV3 CAP in pig tissue sample. PCV3-Mice Liver ORF2: The sequence of PCV3 CAP in the liver tissue of infected mice. PCV3-mice spleen ORF2: The sequence of PCV3 CAP in the spleen tissue of infected mice.Figure 2 MegAlign analysis of the PCV3 CAP gene sequencies

2.5 血清抗體檢測結果

如圖3所示，經(jīng)ELISA檢測小鼠血清抗體，對照組小鼠在整個試驗過程中，血清抗體均保持陰性。PCV3感染組小鼠在感染后第3天血清中開始出現(xiàn)抗體陽性，但此時抗體水平較低，在感染后第7天抗體陽性率顯著升高，隨后血清抗體水平逐漸升高。

圖3 間接ELISA檢測小鼠血清抗體Figure 3 Detection of PCV3 antibodies in the serum of mice by indirect ELISA

3 討論

自2016年美國首次發(fā)現(xiàn)并報道PCV3以來，在世界各地多個國家的豬群中陸續(xù)報道了PCV3的存在，而且與豬皮炎與腎病綜合征、呼吸道疾病綜合征，母豬繁殖障礙，仔豬心臟和多系統(tǒng)炎癥、腹瀉、先天性震顫等疾病的發(fā)生可能相關[3-13]，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟損失。近期有學者報道在中國犬類中檢測到感染PCV3的研究，針對PCV3防控受到越來越多的關注。目前，市場上還未有針對PCV3的疫苗，也未發(fā)現(xiàn)合適的藥物用于預防和治療該病。為了有效地控制該病，預防和控制傳播源，切斷傳播途徑是根本，提高豬場生物安全防護，加強豬群免疫水平有利于對疾病的防控。此外，簡便，快速有效的檢測技術是防控疾病的保障。

本研究中顯示PCV3組織毒感染小鼠不引起明顯的臨床癥狀和病理變化，但可以在小鼠血清和多個組織中檢測到病原存在，說明PCV3可以感染小鼠。在本次研究中，PCV3感染小鼠并不引起明顯臨床癥狀，可能跟病毒劑量較低和毒力較弱相關。組織病理觀察結果顯示在個別小鼠局部肺小葉邊緣有肺泡壁血管擴張淤血，可能是發(fā)病所致，但也不排除實驗過程中操作原因造成的局部淤血。熒光定量PCR檢測結果顯示，在感染早期可以在血清中檢測到PCV3，隨后血清中病毒含量有下降的趨勢；在小鼠肝和脾中病毒含量較高，其他組織中相對較少，因此針對該病的檢測，應在感染早期取樣，優(yōu)選小鼠肝和脾樣品進行檢測。

本研究結果顯示PCV3組織毒可以感染BALB/c小鼠，雖然不表現(xiàn)明顯癥狀，但小鼠可以攜帶病毒，因此滅鼠是預防PCV3流行的一個重要影響因素。