利用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生肌肉特異表達(dá)Cas9的小鼠胚胎

李昊，陳勝男，李松美，樸善花，安鐵洙，王春生

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 動(dòng)物發(fā)育研究室，哈爾濱 150040)

肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN)，是一種骨骼肌細(xì)胞自分泌蛋白，對(duì)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育具有負(fù)調(diào)控作用[1]。MSTN基因過(guò)量表達(dá)可導(dǎo)致動(dòng)物或人肌肉萎縮，而MSNT基因突變或敲除可使動(dòng)物肌肉量增加[2-4]。不過(guò)有研究表明，MSNT基因不僅在骨骼肌中特異性表達(dá)，在胚胎、乳腺[5]、成體心臟、脂肪、腦[6]、肝[7]、肺、腎、舌、小腸以及骨髓中也檢測(cè)到MSTN mRNA存在。敲除MSNT基因后，雖然可以提高肌肉量的增加，但同時(shí)也存在影響個(gè)體發(fā)育甚至是致死等問(wèn)題。對(duì)MSTN基因的研究，不僅可以獲得具有優(yōu)良性狀的禽畜，也可在醫(yī)學(xué)上為肌肉萎縮癥及有關(guān)疾病的改善和治療提供可能性。因此，如何避免MSTN基因研究中的副作用成為目前研究重點(diǎn)。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由Cas9核酸酶和sgRNA構(gòu)成，其中，sgRNA包含一段與靶點(diǎn)PAM序列(NGG)上游互補(bǔ)的序列，可引導(dǎo)Cas9結(jié)合到靶位點(diǎn)并發(fā)揮作用?；蚓庉嬤^(guò)程是通過(guò)內(nèi)源性的DNA雙鏈斷裂途徑，非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(fù)(HDR)來(lái)實(shí)現(xiàn)。相比傳統(tǒng)技術(shù)，CRISPR/Cas9具有設(shè)計(jì)操作簡(jiǎn)單、成本低、特異性高和打靶效率高等優(yōu)點(diǎn)，因此成為當(dāng)今熱門(mén)研究手段之一，靶向基因編輯已成為一種主流研究方法，在基因改造和構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中被廣泛使用。近幾年，不斷有利用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生基因編輯動(dòng)物的報(bào)道[8-10]。

為了建立肌肉特異表達(dá)Cas9小鼠動(dòng)物模型，進(jìn)而研究成體水平上肌肉組織中MSTN的基因編輯。本研究，選取Rosa26作為編輯和打靶位點(diǎn)，通過(guò)顯微注射構(gòu)建了Rosa26位點(diǎn)基因編輯小鼠，同時(shí)獲得了肌肉特異性表達(dá)Cas9蛋白的小鼠打靶胚胎，為后續(xù)產(chǎn)生肌肉特異表達(dá)Cas9蛋白小鼠動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株和載體

6～8周齡SPF級(jí)雌性ICR小鼠200只，體重25～30 g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司【SCXK(遼)2015-0001】；8周齡SPF級(jí)雄性B6D2F1小鼠10只，體重30～35 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】。飼養(yǎng)于東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室【SYXK(黑)2015002】。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各12 h交替，溫度22～25℃，濕度35%～45%。飼養(yǎng)期間給予小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料及潔凈飲用水。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。pMD19-Simple載體購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，pMD19-SP和px459載體為實(shí)驗(yàn)室自存載體。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Endo-free Plasmid Mini Kit II(Omega，D6950-01)，Gel Extraction Kit(CWBIO，CW2302M)，GeneJET Genomic DNA Purification Kit(Thermo，K0721)，TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo，K0441)，TrueCut Cas9 Protein v2(Invitrogen，A36497)，QuickExtract(Lucigen，QE0905T)，限制性內(nèi)切酶(Promega)，Taq酶(TAKARA)，DNA分子量標(biāo)記Marker(TianGen)，其他試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均購(gòu)于Sigma公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

梯度PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))，分光光度計(jì)(Thermo，NanoDrop 2000，美國(guó))，拉針儀(Narishige，PN-30，日本)，鍛熔儀(Narishige，MF-900，日本)，顯微操作儀(Eppendorf，TransferMan NK2，德國(guó))，倒置熒光顯微鏡(Carl Zeiss，Axiovert 200，德國(guó))，CCD成像系統(tǒng)(Nikon，DS-Fi1，日本)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的設(shè)計(jì)與獲得

(1)sgRNA的設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)Rosa26位點(diǎn)sgRNA，上游引物mRosa26-gRNA-PCRF，下游引物mRosa26-gRNA-universal-PCRR，引物序列詳情見(jiàn)表1，引物送哈爾濱睿博興科生物技術(shù)有限公司公司合成。

(2)退火形成雙鏈DNA

反應(yīng)組成：mRosa26-gRNA-PCRF(10 μmol/L)2.5 μL， mRosa26-gRNA-universal-PCRR(10 μmol/L)2.5 μL，2×Premix LA Taq 25 μL，ddH2O 20 μL，反應(yīng)體系：50 μL。退火條件：98℃ 2 min；98℃ 10 s、53℃ 20 s、72℃ 30 s、20個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

(3)sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄

反應(yīng)組成：雙鏈DNA 5 μL，5× reaction buffer 4 μL，GTP solution 2 μL，UTP solution 2 μL，CTP solution 2 μL，T7 RNA polymerase mix 2 μL，補(bǔ)加RNase-free H2O到20 μL，反應(yīng)體系：20 μL。混勻后，37℃孵育6 h，然后加DNase Ⅰ 1 μL，37℃孵育15 min；純化，分裝，-80℃保存。

1.2.2 sgRNA和Cas9蛋白的體外酶切驗(yàn)證

(1)小鼠Rosa26基因靶DNA的擴(kuò)增

引物為上游mRosa26-Xba-F1和下游mRosa26-Xba-R1，引物序列詳情見(jiàn)表1。反應(yīng)組成：基因組DNA 1 μL(50 ng)，mRosa26-Xba-F1 0.5 μL，mRosa26-Xba-R1 0.5 μL，2×LA Mix 10 μL，補(bǔ)加ddH2O 到20 μL，反應(yīng)體系：20 μL。擴(kuò)增條件：98℃ 5 min；98℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s、35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。

(2)sgRNA和Cas9蛋白的體外酶切

將80 ng的Rosa26靶DNA模板和150 ng的Cas9蛋白混合，37℃孵育30 min，加200 ng sgRNA，1 μL NEB Buffer 3和1 μL 10 mmol/L BSA，混合均勻，37℃下作用1.5 h，酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證酶切效果。

1.2.3 小鼠Rosa26位點(diǎn)肌肉特異性同源打靶載體的構(gòu)建

(1)SP-px459載體構(gòu)建

采用限制性內(nèi)切酶KpnI和AgeI對(duì)pMD19-SP和px459載體進(jìn)行酶切，將回收的SP啟動(dòng)子和去除CMV啟動(dòng)子的px459載體大片段連接，構(gòu)建SP-px459載體。

(2)SP-px459載體的PCR擴(kuò)增

設(shè)計(jì)引物T-MluI-SP-F和T-BstBI-R，并在上下游引物兩端引入與Donor載體酶切位點(diǎn)兩側(cè)同源的15 bp序列，引物序列詳情見(jiàn)表1。反應(yīng)組成：SP-px459 3 μL、T-MluI-SP-F 3 μL、T-BstBI-R 3 μL、2× Premix LA Taq 50 μL、ddH2O 41 μL，反應(yīng)體系：100 μL。反應(yīng)條件：98℃ 1 min；98℃ 10 s、65℃ 30 s、72℃ 7 min、30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

(3)同源臂載體的酶切

使用限制性內(nèi)切酶MluI和BstBI對(duì)小鼠ROSA26 Safe Harbor 基因敲入試劑盒中的DC-DON-SH02 ROSA26(Donor)載體，進(jìn)行酶切，膠回收大片段，并置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

(4)Donor-SP-px459載體的構(gòu)建

取上述PCR膠回收產(chǎn)物40 ng，Donor酶切回收產(chǎn)物50 ng，加1 μL Exnase II，2 μL的5 × CE II Buffer，補(bǔ)加ddH2O到10 μL，進(jìn)行同源重組連接。

1.2.4Rosa26位點(diǎn)基因編輯小鼠胚胎的獲得

選擇6～8周大性成熟的雌性ICR小鼠，間隔48 h分別注射10 IU的PMSG和hCG，并與雄性B6D2F1小鼠合籠，見(jiàn)栓小鼠采用輸卵管灌流收集原核期胚胎，隨后采用原核注射方式將Rosa26 sgRNA和Cas9蛋白注射到受精卵的雄原核，隨后觀察胚胎的卵裂和囊胚發(fā)育情況。

1.2.5Rosa26位點(diǎn)基因編輯小鼠胚胎的鑒定

(1)囊胚收集處理

收集注射后囊胚加入快速DNA提取試劑，每10 μL裂解液放入1枚囊胚。隨后進(jìn)行變性處理，變性程序：68℃ 6 min、98℃ 2 min。

(2)兩輪PCR擴(kuò)增

以變性后的DNA作為模板，以mRosa26-Xba-F1和mRosa26-Xba-R1為引物，進(jìn)行兩輪PCR。一輪PCR反應(yīng)組成：胚胎裂解液10 μL，mRosa26-Xba-F1 0.3 μL，mRosa26-Xba-R1 0.3 μL，2×Premix LA Taq 10 μL，反應(yīng)體系：20.6 μL。二輪PCR反應(yīng)組成：一輪PCR產(chǎn)物5 μL，mRosa26-Xba-F1 0.3 μL，mRosa26-Xba-R1 0.3 μL，2×Premix LA Taq 10 μL，ddH2O 4.4 μL，反應(yīng)體系：20 μL。PCR 反應(yīng)條件為：98℃ 3 min；95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s、30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。

1.2.6Rosa26位點(diǎn)基因編輯小鼠的制作

原核注射后，將發(fā)育到囊胚階段的小鼠胚胎，以每側(cè)7～8枚的數(shù)量，通過(guò)子宮移植的方法，移植到同步發(fā)情的3.5 d或2.5 d受體母鼠子宮，待其生產(chǎn)。

1.2.7Rosa26位點(diǎn)基因編輯小鼠的鑒定

取出生4周小鼠尾尖，提取小鼠尾尖DNA，以mRosa26-Xba-F1和mRosa26-Xba-R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)組成和擴(kuò)增條件見(jiàn)1.2.2。PCR產(chǎn)物送生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.8Rosa26位點(diǎn)肌肉特異性打靶胚胎的獲得

采用1.2.4方法收集小鼠原核期胚胎，同樣采用原核注射方式將同源打靶載體Donor-SP-px459以質(zhì)粒的形式與Rosa26 sgRNA和Cas9蛋白一起注射到受精卵的雄原核中，隨后觀察胚胎的卵裂和囊胚發(fā)育情況。

1.2.9Rosa26位點(diǎn)肌肉特異性打靶胚胎的鑒定

使用小鼠ROSA26 Safe Harbor 基因敲入試劑盒提供的通用鑒定引物3’-Poly(A)-F和3’-Poly(A)-R對(duì)打靶載體的整合情況進(jìn)行鑒定，引物序列詳情見(jiàn)表1。兩輪PCR反應(yīng)組成和反應(yīng)條件同1.2.5。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 靶DNA擴(kuò)增和sgRNA體外酶切驗(yàn)證

擴(kuò)增的小鼠Rosa26基因靶DNA大小約為600 bp，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，在600 bp左右可以觀察到條帶，說(shuō)明擴(kuò)增成功(圖1A)。sgRNA和Cas9蛋白對(duì)靶DNA酶切后產(chǎn)生的條帶大小約200 bp和400 bp，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，在體外酶切驗(yàn)證體系中同時(shí)加入sgRNA和Cas9蛋白，電泳后可在約200 bp和400 bp處觀察到條帶，說(shuō)明酶切成功(圖1B)，而未加入sgRNA和Cas9或單獨(dú)加入sgRNA或Cas9蛋白時(shí)未觀察到特定條帶出現(xiàn)。

注：A，Rosa26靶DNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；M，Marker I DNA ladder；1，陰性對(duì)照；2，PCR產(chǎn)物。B，Rosa26靶DNA體外酶切驗(yàn)證瓊脂糖凝膠電泳圖；1，陰性對(duì)照；2，sgRNA+Cas9；3，sgRNA；4，Cas9；M，Marker I DNA ladder.圖1 Rosa26靶DNA PCR產(chǎn)物和sgRNA體外酶切驗(yàn)證瓊脂糖凝膠電泳圖Note. A. Agarose gel electrophoresis result of Rosa26 target DNA PCR product. M, Marker I DNA ladder. 1, Control. 2, PCR product. B. Agarose gel electrophoresis results of sgRNA in vitro cleavage assay products. 1, Control. 2, sgRNA + Cas9.3, sgRNA. 4, Cas9.M, Marker I DNA ladder.Figure 1 Results of agarose gel electrophoresis of Rosa26 target DNA PCR and sgRNA in vitro cleavage assay products

2.2 肌肉特異表達(dá)同源打靶載體的構(gòu)建

構(gòu)建的SP-px459載體的PCR產(chǎn)物大小約為5000 bp，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，可以在約5000 bp左右觀察到條帶出現(xiàn)，說(shuō)明載體構(gòu)建成功(圖2A)。構(gòu)建的同源打靶載體Donor-SP-px459的大小約為13 000 bp左右，瓊脂糖凝膠電泳后，在約13 000 bp處觀察到條帶，說(shuō)明載體構(gòu)建成功(圖2B)。

注：A，SP-px459的PCR產(chǎn)物；M，DL 5000 Plus marker；1，陰性對(duì)照；2，PCR產(chǎn)物。 B，Donor-SP-px459載體的瓊脂糖凝膠電泳圖；M，DL 2503 marker；1，Donor-SP-px459載體；2，陰性對(duì)照。圖2 SP-px459 PCR產(chǎn)物和Donor-SP-px459的載體構(gòu)建Note. A. PCR products of SP-px459. M, DL 5000 Plus. 1, Control. 2, PCR Products. B. Agarose gel electrophoresis of donor-SP-px459 vector. M, DL 2503 marker. 1, Donor-SP-px459 vector. 2, Control.Figure 2 PCR products of SP-px459 and vector construction of donor-SP-px459

2.3 小鼠Rosa26基因編輯胚胎的獲得

注射了Rosa26的sgRNA和Cas9蛋白的胚胎可以正常卵裂并可發(fā)育到囊胚階段(圖3)。在挑取了94個(gè)原核時(shí)期胚胎進(jìn)行注射后，有85個(gè)胚胎存活，有9枚胚胎在注射后發(fā)生崩解；注射后觀察細(xì)胞卵裂情況，其中有78枚胚胎分裂形成二細(xì)胞，卵裂率為91.8%；分裂后的胚胎最終由40枚發(fā)育到囊胚，囊胚率為51.3%。注射后得到的囊胚(圖4A)，經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳后，20個(gè)囊胚中有19個(gè)出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增條帶(圖4B)；測(cè)序結(jié)果顯示，在測(cè)序的6個(gè)樣品中有1個(gè)發(fā)生了基因缺失編輯(圖4C，4D)。

圖3 注射Rosa26 sgRNA/Cas9后小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程(×200)Figure 3 Process of embryos development after Rosa26 sgRNA/Cas9 microinjection(×200)

注：A，合子注射后形成的囊胚。B，囊胚PCR產(chǎn)物。C，序列比對(duì)結(jié)果。D，測(cè)序峰圖結(jié)果。圖4 小鼠Rosa26基因編輯胚胎的鑒定Note. A, Blastocysts formed after zygotic injection. B, PCR products of blastulae. C, Sequence alignment. D, Sequencing peak map.Figure 4 Identification of mouse Rosa26 gene edited embryos

2.4 Rosa26基因編輯小鼠的獲得

采用子宮移植的方法，將96枚注射后的囊胚移植到同步發(fā)情的6只受體體內(nèi)，其中4只沒(méi)有觀察到妊娠反應(yīng)，最終有1只產(chǎn)下3只小鼠(圖5A)。鼠尾DNA，PCR擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在600 bp左右出現(xiàn)目的條帶(圖5B)，測(cè)序結(jié)果顯示，其中一只小鼠的Rosa26位點(diǎn)發(fā)生了點(diǎn)突變(圖5C，5D)。

注：A，胚胎移植和獲得的后代。B，基因組PCR產(chǎn)物電泳圖；1～3：移植后產(chǎn)生的后代。C，序列比對(duì)結(jié)果。D，測(cè)序峰圖結(jié)果。圖5 Rosa26基因編輯小鼠的鑒定Note. A, Embryo transfer and acquired offsprings. B, Electropherogram of genomic PCR identification products, lane1～3, offsprings after embryo transfer. C, Sequence alignment. D, Sequencing peak map.Figure 5 Identification of Rosa26 gene edited mice

2.5 肌肉特異表達(dá)Cas9蛋白小鼠胚胎的獲得

打靶載體Donor-SP-px459與Rosa26 sgRNA和Cas9蛋白聯(lián)合注射后，胚胎可以正常卵裂并可發(fā)育到囊胚階段(圖6)。注射打靶載體Donor-SP-px459的胚胎的卵裂率為87.1%，囊胚率為27.8%。注射了Donor-SP-px459的胚胎中未見(jiàn)有熒光(圖7)。注射了打靶載體的胚胎，PCR擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約1400 bp大小處擴(kuò)增出特異性條帶(圖8)，說(shuō)明同源打靶載體已成功整合到打靶位點(diǎn)。

圖6 注射打靶載體Donor-SP-px459后小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程(×200)Figure 6 Process of embryos development after Donor-SP-px459 microinjection(×200)

圖7 注射打靶載體后胚胎熒光蛋白表達(dá)情況Figure 7 Expression of fluorescent protein after microinjection of targeting vector into the embryos

注：1，DL 2000 Marker。2～4，注射打靶載體胚胎PCR產(chǎn)物。圖8 注射打靶載體胚胎的PCR鑒定Note. 1, DL 2000 marker. 2～4, PCR identification products of embryos injected with targeting vectors.Figure 8 PCR identification of embryos injected with targeting vectors

3 討論

由工程化核酸酶引發(fā)的DNA雙鏈斷裂(double-strain break，DSB)被認(rèn)為是產(chǎn)生定向突變的強(qiáng)有力工具，例如鋅指核酸酶(ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)等[11-12]，不過(guò)CRISPR/Cas9的出現(xiàn)，為基因的定點(diǎn)修飾提供了一個(gè)更加簡(jiǎn)單有效的方法[13-14]。相比于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因手段使用外源基因進(jìn)行原核注射的方式生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物帶來(lái)的整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)不確定等問(wèn)題，工程化核酸酶系統(tǒng)可以在基因靶位點(diǎn)上產(chǎn)生精準(zhǔn)突變。Rosa26位點(diǎn)最初是由基因誘捕載體Rosaβ-geo與26號(hào)轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞發(fā)生整合而被發(fā)現(xiàn)[15]。并被廣泛用于基于ES細(xì)胞的基因打靶操作。該基因位于小鼠基因組的第6號(hào)染色體上，由3個(gè)外顯子組成，可在所有細(xì)胞類型和發(fā)育階段實(shí)現(xiàn)廣泛表達(dá)。Rosa26的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是一種非編碼、非必需的核RNA，不會(huì)翻譯成為蛋白質(zhì)[16]。也因此，Rosa26基因位點(diǎn)被稱為“安全港”，常被用做外源基因整合位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)常規(guī)和條件性的基因表達(dá)。近幾年，不斷有利用Rosa26位點(diǎn)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的報(bào)道出現(xiàn)[17-18]。本研究同樣也采用了Rosa26位點(diǎn)作為基因打靶的位點(diǎn)。在CRISPR/Cas9體系中sgRNA的設(shè)計(jì)是基因編輯成功的關(guān)鍵，因此通常在注射之前，需要先在體外對(duì)靶DNA位點(diǎn)進(jìn)行酶切來(lái)檢驗(yàn)sgRNA可用性和Cas9蛋白的活性，本研究中設(shè)計(jì)構(gòu)建的Rosa26的sgRNA的體外酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA可以正常發(fā)揮編輯作用，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了顯微注射，并先后得到了Rosa26位點(diǎn)的基因編輯胚胎和定點(diǎn)突變小鼠，從而初步建立了基于CRISPR/Cas9的基因編輯體系，驗(yàn)證了整個(gè)體系的有效性。

組織特異性表達(dá)外源基因在研究基因功能、細(xì)胞分化和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要作用，通過(guò)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生組織特異性動(dòng)物模型是常用的研究方法之一。組織特異性啟動(dòng)子可以帶動(dòng)外源基因在特定組織中表達(dá)，因此，通過(guò)Rosa26位點(diǎn)打靶敲入肌肉特異性表達(dá)的CRISPR/Cas9載體，就可以實(shí)現(xiàn)在肌肉組織中特異表達(dá)Cas9蛋白，為后續(xù)產(chǎn)生肌肉特異性表達(dá)Cas9的動(dòng)物模型及相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。常用的骨骼肌特異性啟動(dòng)子有α-actin啟動(dòng)子和合成肌肉啟動(dòng)子(synthetic muscle promoters SP)，其中，α-actin啟動(dòng)子在非骨骼肌細(xì)胞中沒(méi)有活性，其組成結(jié)構(gòu)包含E-box和SRE調(diào)控區(qū)，可以被IGF-I和MyoG直接或間接的激活；1999年，Li等[19]根據(jù)骨骼肌α-actin的結(jié)構(gòu)特性，對(duì)肌肉增強(qiáng)子進(jìn)行分析并利用順式作用元件和作用調(diào)控因子相對(duì)位置，人工設(shè)計(jì)了表達(dá)效率遠(yuǎn)高于天然肌源性啟動(dòng)子和病毒啟動(dòng)子的啟動(dòng)子序列-合成肌肉啟動(dòng)子SP。SP啟動(dòng)子由SRE、TEF-1、MEF-1和MEF-2等4種作用序列元件組成，由于這些元件的存在使得SP在已分化的肌肉組織中的轉(zhuǎn)錄能力得到極大增強(qiáng)。在研究室前期工作中，我們?nèi)斯ず铣闪薙P啟動(dòng)子并連接到了克隆載體，在本研究中，我們將SP啟動(dòng)子與切除了CMV啟動(dòng)子的px459載體連接，隨后又通過(guò)PCR和同源重組的方法將核心序列與同源臂載體Donor載體連接，并獲得肌肉特異性的同源打靶載體Donor-SP-px459，通過(guò)顯微注射，最終獲得了小鼠肌肉特異性打靶胚胎，同時(shí)進(jìn)行了胚胎移植，但暫時(shí)未成功獲得打靶個(gè)體。本研究中，注射了同源打靶載體的胚胎，每6個(gè)囊胚中就有1個(gè)胚胎發(fā)生整合，整合效率達(dá)到了16.7%。這可能與同源臂大小的選擇和商業(yè)化蛋白的使用有關(guān)。以往研究中，同源臂的大小一般幾百到幾千大小都有被使用的報(bào)道，但最近有報(bào)道稱同源臂在800 bp左右時(shí)打靶效率最高[20]，為此我們也采用了800 bp的同源臂來(lái)構(gòu)建打靶載體；此外，其他類似研究中多采用Cas9 mRNA和sgRNA的組合進(jìn)行，本研究是采用商業(yè)化的Cas9蛋白進(jìn)行的。

雖然通過(guò)基因敲除可以獲得MSNT基因突變個(gè)體，但由MSTN基因缺失所導(dǎo)致的問(wèn)題和不確定性尚未被解決，尤其是涉及到基因編輯動(dòng)物的生物安全性問(wèn)題。因此，如何在充分利用MSTN特性來(lái)獲得優(yōu)良性狀的同時(shí)，又能兼顧生物安全性產(chǎn)生理想個(gè)體，是當(dāng)下研究的方向和重點(diǎn)。因此，接下來(lái)我們將在現(xiàn)有打靶胚胎的基礎(chǔ)上，通過(guò)胚胎移植獲得肌肉特異表達(dá)Cas9的小鼠，并嘗試在成體水平上通過(guò)病毒攜帶等方式實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠MSTN基因的編輯，從而達(dá)到使小鼠肌肉量增加的目的。