基于HPLC聯(lián)合ICP-MS法測定活血止痛膠囊中總砷、可溶性砷、價態(tài)砷

陳榮，張華鋒

（蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104）

活血止痛膠囊組方為當(dāng)歸、三七、醋乳香、冰片、 土鱉蟲、鍛自然銅等六味，收錄于2015年版《中國藥典》一部，功能為活血散瘀，消腫止痛，用于跌打損傷，瘀血腫痛?！吨袊幍洹穂1]對此藥含鉛、砷、汞量作出規(guī)定，其中砷含量不得過300 mg/kg，遠(yuǎn)高于一般藥物的2 mg/kg。有研究表明[2]，當(dāng)歸藥材對砷元素有明顯吸附作用，對不同產(chǎn)地三七樣品進(jìn)行分析，砷超標(biāo)率為32.4%[3]，土鱉蟲由于人為增重，食物團(tuán)比蟲體含砷量明顯提高[4]，自然銅作為一種礦物藥，成因復(fù)雜，往往含有較高的重金屬及有害元素。因此，評價活血止痛膠囊安全性必須要考慮砷含量問題。而不同砷價態(tài)，毒性差別很大。毒性一般為無機(jī)砷＞有機(jī)砷，亞砷酸（三價砷）＞砷酸鹽（五價砷）＞一甲基砷、二甲基砷，砷甜菜堿和砷膽堿無毒[5]。本實(shí)驗(yàn)采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）測定活血止痛膠囊中總砷及可溶性砷含量，再以高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS）法測定價態(tài)砷的含量，以期為科學(xué)評價活血止痛膠囊安全性提供參考。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器與試劑

儀器：7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；CEM MARS 6 CLASSIC 微波消解儀（美國培安公司）；Millipore Synergy超純水機(jī)（美國Millipore公司）；SK5200 HP超聲波清洗器（上?？茘u超聲儀器有限公司，53 kHz，200 W）；Thermo Fisher Multifuge X3離心機(jī)（美國Thermo Fisher科技公司）。

試劑：亞砷酸（AsⅢ，1704）、砷酸鹽（AsV，1704）、一甲基砷（MMA，1707）、二甲基砷（DMA，1704）、砷甜菜堿（AsB，1607）和砷膽堿（AsC，1607）溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購于中國科學(xué)計(jì)量研究院；砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（174049-3）購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心，濃度為1 000 μg/mL；內(nèi)標(biāo)溶液（含Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh、Sc、Tb 各 100 μg/mL）和調(diào)諧液（含 Ce、Co、Li、Mg、TI、Y 各 1 μg/L）均購于美國Agilent 公司。胃蛋白酶和胰蛋白酶均為生化試劑，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，酶活力（U/g）分別為≥1 200和≥50 000。實(shí)驗(yàn)用水為Millpore超純水機(jī)所產(chǎn)超純水，其他試劑均為優(yōu)級純。

1.2 材料

本實(shí)驗(yàn)共收集7批樣品，其中A廠3批（16070119、16080118、17020128，編號1、2、3）；B廠3批（20161208、20161011、20161209，編號 4、5、6）；C 廠 1 批（160915，編號 7）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總砷量和可溶性砷含量測定

2.1.1 ICP-MS工作條件以高純氬為工作氣和載氣，氦氣為反應(yīng)氣；采用碰撞反應(yīng)池模式；射頻功率1550 W；載氣流量1.09 L/min；采樣深度10.0 mm；霧化室溫度2℃；數(shù)據(jù)采集重復(fù)次數(shù)3，積分時間1 S；蠕動泵轉(zhuǎn)速0.1 rps。

2.1.2 對照品溶液配制精密量取砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸稀釋至2 μg/mL，作為砷單元素貯備液，再以2%硝酸稀釋成0、1、5、10、50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.3 供試品溶液制備

2.1.3.1 總砷量供試品制備取供試品10粒，將內(nèi)容物研細(xì)混勻，取供試品約0.4 g，精密稱定，加硝酸8 mL，置加熱板上90℃預(yù)消解30分鐘，冷卻后用微波消解儀消解。消解程序：1000 W，爬坡5分鐘，120℃保持10分鐘；1400 W，爬坡10分鐘，185℃保持25分鐘。取出，將消解液轉(zhuǎn)入50 mL塑料量瓶中，用水洗滌3次，洗液合并于量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。離心（3 000 r/min，5 min），精密量取上清液1 mL，置50 mL塑料量瓶中，用水稀釋至刻度，即得。同法制備空白溶液。

2.1.3.2 可溶性砷供試品制備取供試品10粒，將內(nèi)容物研細(xì)混勻，取供試品約0.3 g各兩份，精密稱定，置50 mL塑料量瓶中，分別加入人工胃液和人工腸液至刻度，并稱定重量。超聲使供試品徹底溶散，再置于37℃水浴中超聲2 h（53 kHz，200 W）并不時震蕩搖勻。冷卻過夜（＞24 h），精密量取中層液體10 mL置離心管中，離心（3 000 r/min，5 min），精密量取上清液5 mL，至10 mL塑料量瓶中，加0.02 mol/L EDTA-2Na至刻度，精密量取1 mL至頂空進(jìn)樣瓶中，加2 mL硝酸和0.5 mL鹽酸，密閉，90℃烘箱中反應(yīng)1 h，冷卻后用水洗入10 mL塑料量瓶中，并稀釋至刻度，即得。同法制備空白溶液。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 線性關(guān)系考察按測定條件以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對照品峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Y= 0.0017X+ 1.6811×10-5（R= 1.0000），線性范圍1～50 ng/mL。

2.1.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)將樣品1（16070119）分別按照2.1.3.1、2.1.3.2方法各制備6份，測得總砷量RSD（n=6）為7.8%，測得可溶性砷含量RSD（n=6，人工胃液）11.5%和RSD（n=6，人工腸液）為10.8%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.3 加樣回收試驗(yàn)稱取樣品5（20161011）約0.2 g，精密稱定，在測定總砷量時精密加入砷單元素標(biāo)準(zhǔn) 溶 液（1 000 μg/mL）40、60、80 μL（ 各 3份 ），按照2.2.3.1項(xiàng)下方法制備，測得平均加樣回收率為98.4%，RSD（n=9）為9.4%；在測定可溶性砷含量時精密加入砷單元素貯備液（2 μg/mL）200、250、300 μL（各3份），按照2.2.3.2項(xiàng)下方法制備，測得人工胃液處理的平均加樣回收率為89.2%，RSD（n=9）為11.7%，測得人工腸液處理的平均加樣回收率為90.8%，RSD（n=9）為7.2%。

2.1.4.4 檢出限標(biāo)樣空白溶液連續(xù)測定11次，以信號響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（δ）的3 倍所對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限，測定砷的檢出限為0.01 ng/g。

2.1.5 總砷量和可溶性砷含量測定7批樣品的可溶性砷含量低于總砷量，占總砷比例較低。見表1。

表1 砷含有量測定結(jié)果

2.2 價態(tài)砷含量測定

2.2.1 ICP-MS工作條件和HPLC色譜條件 ICP-MS工作條件、參數(shù)設(shè)置與2.1.1基本相同，載氣流量1.10 L/min，蠕動泵轉(zhuǎn)速0.4 rps。色譜柱：Hamilton PRP-X100（250×4.1 mm，10 μm），0.025 mol/L 磷酸二氫銨溶液（氨水調(diào)節(jié)pH至8.0）為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫（0～15 min，流動相A從0→100%；15～20 min，流動相A從100%→0；20～25 min，流動相A為0），流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.2 對照品溶液制備精密稱取亞砷酸、砷酸鹽、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿和砷膽堿適量（以砷As計(jì)），加水制成各含2 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，再加 0.02 mol/L EDTA-2Na制成 0，5，20，50，100，500 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.3 供試品溶液制備同2.1.3.2項(xiàng)下方法制備，并同法制備空白。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系考察按測定條件以各價態(tài)砷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以及相應(yīng)峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各價態(tài)砷在相應(yīng)范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，見圖1及表2。

圖1 6 種價態(tài)砷 HPLC-ICP-MS 色譜圖

2.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)7批樣品都只檢出亞砷酸（AsⅢ），將樣品1（16070119）分別按照2.2.3方法制備6份，測得亞砷酸根含量RSD（n=6，人工胃液）為7.5%和RSD（n=6，人工腸液）為11.0%，說明該方法重復(fù)性良好。

表2 各價態(tài)砷線性關(guān)系

2.2.4.3 加樣回收試驗(yàn)稱取樣品5（20161011）約0.2 g，精密稱定，分別加入亞砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.04、0.06、0.08 g（以砷 As計(jì)，濃度為 75.7 μg/g），精密稱定各 3 份，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備，測得人工胃液處理的平均加樣回收率為91.9%，RSD（n=9）為6.3%，測得人工腸液處理的平均加樣回收率為88.4%，RSD（n=9）為9.2%。

2.2.4.4 檢出限以信噪比（S/N）為3∶1時所對應(yīng)的濃度為檢出限，計(jì)算得到6種價態(tài)砷的檢出限分別為：砷膽堿0.19 ng/g；砷甜菜堿0.25 ng/g；亞砷酸根0.35 ng/g；二甲基砷0.50 ng/g；一甲基砷1.02 ng/g；砷酸根0.04 ng/g

2.2.5 樣品中砷價態(tài)的測定7批樣品三價砷含量測定結(jié)果見圖2及表3。

圖2 樣品HPLC-ICP-MS 色譜圖

表3 樣品中三價砷含量測定結(jié)果

3 討論

含重金屬中藥的毒性與所含重金屬元素價態(tài)、形態(tài)密切相關(guān)，僅采用重金屬總含量來判定藥物的安全性并不合理。特別是中藥復(fù)方制劑配伍，及中藥中重金屬在體內(nèi)吸收、代謝變化規(guī)律都有待進(jìn)一步研究。

活血止痛膠囊是含礦物藥自然銅的復(fù)方制劑，生產(chǎn)前后存在砷污染的高風(fēng)險。本實(shí)驗(yàn)采用微波消解技術(shù)提取總砷，同時模擬人體胃腸道環(huán)境，分別以人工胃液、腸液提取可溶性砷、價態(tài)砷，結(jié)合HPLC-ICPMS技術(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示①活血止痛膠囊可溶性砷及價態(tài)砷均遠(yuǎn)低于總砷含量，按照體重60 Kg每日最大攝入量3 g計(jì)算，可溶性砷攝入量也遠(yuǎn)低于WHO規(guī)定的0.12 mg[6]。②3家廠商測得總砷量相差較大，但同一家不同批次間相差不多；③7批樣品經(jīng)人工胃液和腸液分別提取后測得的可溶性砷含量，人工胃液＞人工腸液，各批亞砷酸占可溶性砷的比例，人工腸液＞人工胃液。多數(shù)含有砷的礦物藥是以As（Ⅲ)、As（V）的形式存在，其中As（Ⅲ）毒性更高（約是五價砷的60倍），是造成急性砷中毒的主要兇手[7]。而重金屬及有害元素的生物活性只有在被吸收后才能表現(xiàn)出來，因此在活血止痛膠囊中控制可溶性砷及三價砷含量比單純控制總砷量更為重要。

活血止痛膠囊雖然存在總砷量較高的風(fēng)險，但在人體內(nèi)溶出量有限，價態(tài)砷含量很低，這可能是因?yàn)椋孩俜街胁捎缅懽匀汇~入藥，自然銅是硫化物類礦物黃鐵礦（FeS2)，晶型多呈立方體，集合體呈致密塊狀[7]，經(jīng)鍛淬后，有害元素大大下降，隨著炮制溫度升高，砷、鉛含量均下降[8]，主成分FeS2化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，難溶于水，微溶于酸，消解困難，在人胃腸液作用下，砷很難溶出；②本實(shí)驗(yàn)只檢出亞砷酸，且含量與可溶性砷量并不成正比，可能方中砷以實(shí)驗(yàn)以外其他價態(tài)存在；③方中其他藥材如果在源頭控制住質(zhì)量，砷超標(biāo)的風(fēng)險就會降低，價態(tài)砷也不會超標(biāo)。

綜上所述，控制含砷風(fēng)險高的中成藥質(zhì)量，測定可溶性砷及砷價態(tài)含量比單純制定總砷標(biāo)準(zhǔn)更為科學(xué)合理。本實(shí)驗(yàn)采用ICP-MS法測定活血止痛膠囊總砷量及可溶性砷含量，同時采用HPLC-ICP-MS測定本品價態(tài)砷含量，為活血止痛膠囊的安全性評價提供參考。