基于金銀合金薄膜的高靈敏度寬光譜表面等離子體共振成像傳感器

梁爽，高然，張萌穎，薛寧，祁志美,＊

1中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所，傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100190

1 引言

表面等離子體共振成像(surface plasmon resonance imaging，SPRI)是一種消逝波傳感技術(shù)，主要用于對(duì)生化樣品進(jìn)行原位實(shí)時(shí)非標(biāo)記探測(cè)。SPRI在幾何光學(xué)上是一種棱鏡全反射光束成像，只不過(guò)入射光束在消逝場(chǎng)作用下與設(shè)置于棱鏡全反射面上的金、銀等貴金屬薄膜的表面等離激元(SPP)發(fā)生了共振耦合，使得反射光的強(qiáng)度、位相、或波長(zhǎng)受到SPP的強(qiáng)烈調(diào)制，從而攜帶了關(guān)于薄膜表面的一些物理、化學(xué)信息，這些信息經(jīng)圖像記錄和圖像解析可以被獲取和利用。SPRI不僅具有一定的二維空間分辨率，能夠同步檢測(cè)芯片表面不同位點(diǎn)的生化反應(yīng)，而且具有較高的時(shí)間分辨率，能夠?qū)崟r(shí)跟蹤不同位點(diǎn)的生化反應(yīng)過(guò)程。自從 1987年Yeatman首次利用激光光源開(kāi)展單色SPRI研究之后1，該技術(shù)在國(guó)際上引起了高度重視和廣泛研究，現(xiàn)已獲得商業(yè)化開(kāi)發(fā)，并被應(yīng)用于生物制藥、生命科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域2-6。單波長(zhǎng)SPRI裝置通過(guò)在給定入射角下測(cè)量圖像灰度的變化完成生化樣品的檢測(cè)，動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍較窄，一次成像難以反映成像區(qū)域所有位點(diǎn)的生化反應(yīng)。Knobloch等人7于1996年首次利用白光光源獲得了SPR彩色圖像。相比于SPR灰度像，SPR彩色圖像包含波長(zhǎng)信息，動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍寬，原則上一次成像能夠提供整個(gè)成像區(qū)域所有位點(diǎn)的生化反應(yīng)信息8-10。但是，如何從共振彩像中提取出只與波長(zhǎng)相關(guān)的參數(shù)？這一關(guān)鍵問(wèn)題直到 2006年才被香港學(xué)者Ho等人突破11。在此之前，彩色SPRI也只是用于直觀的圖像分析，不能進(jìn)行定量檢測(cè)。Ho等人11將SPR彩像在HSV顏色空間12進(jìn)行處理，得出共振彩像的色相(Hue)分布。色相只與決定圖像顏色的波長(zhǎng)有關(guān)，而SPR彩像的顏色取決于共振波長(zhǎng)，因此彩色SPRI能夠借助色相算法對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)。我國(guó)對(duì)SPR傳感技術(shù)非常重視，研究單位較多，主要包括中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所和化學(xué)研究所，以及清華大學(xué)和深圳大學(xué)13-16。中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所陳義課題組早在2007年就研制出了彩色SPRI裝置，但他們未對(duì)儀器的定量檢測(cè)功能進(jìn)行開(kāi)發(fā)和利用17,18。2017年本課題組將色相算法與寬光譜SPRI技術(shù)相結(jié)合，利用聚四氟乙烯涂覆的金膜傳感芯片，實(shí)現(xiàn)了對(duì)水中強(qiáng)致癌性苯并芘分子的原位圖像分析和定量檢測(cè)19,20，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了傳感器基于二維色相分布的微觀尺度局域定量探測(cè)本領(lǐng)。

金膜SPRI傳感芯片化學(xué)穩(wěn)定性好，但是檢測(cè)成本較高，靈敏度有限，不足以探測(cè)分子量低于200 Da的生化小分子21,22。銀膜SPRI傳感器雖然靈敏度高，但化學(xué)穩(wěn)定性差23。為了克服現(xiàn)有SPRI傳感器的不足，本文成功研制出基于金銀合金薄膜的寬光譜 SPRI傳感器。金銀合金薄膜穩(wěn)定性好，場(chǎng)增強(qiáng)因子高，能夠?qū)е卤冉鹉PR傳感芯片更高的檢測(cè)靈敏度，有效降低檢測(cè)成本24-26。本文通過(guò)對(duì)金銀合金薄膜SPP共振波長(zhǎng)和共振彩像進(jìn)行同步測(cè)量，結(jié)合色相算法對(duì)共振彩像的處理，建立了共振彩像的色相值與共振波長(zhǎng)的依賴關(guān)系，獲得了共振彩像的色相對(duì)表界面生化反應(yīng)最為敏感的光譜區(qū)域。在此基礎(chǔ)上測(cè)試了金銀合金薄膜SPR彩像的色相對(duì)液體折射率的靈敏度和對(duì)牛血清蛋白(BSA)分子吸附的動(dòng)態(tài)響應(yīng)，并與金膜SPRI傳感器的折射率靈敏度進(jìn)行了比較。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 金銀合金薄膜SPR傳感芯片的制備

用于制備SPR傳感芯片的玻璃基底購(gòu)自日本Matsunami Glass株式會(huì)社(厚度 0.9 mm，n =1.522@λ = 633 nm)，用于淀積金銀合金薄膜的濺射靶購(gòu)自北京翠鉑林有色金屬技術(shù)開(kāi)發(fā)中心有限公司，濺射靶由質(zhì)量比為1 : 1的金銀合金制得。在制備SPR傳感芯片時(shí)，首先用丙酮、乙醇、Milli-Q超純水依次超聲清洗玻璃基片，基片被烘干后放入射頻濺射裝置的腔室內(nèi)，首先經(jīng)歷 3 min氧等離子體刻蝕以去除玻璃表面的吸附分子，然后在基片表面依次淀積3 nm鉻和50 nm厚的金銀合金薄膜，由此形成SPR傳感芯片。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器的構(gòu)建

設(shè)計(jì)制備了Kretschmann結(jié)構(gòu)多功能平臺(tái)，該平臺(tái)能夠同步測(cè)試SPR共振光譜與共振圖像，其關(guān)鍵部件包括：LS-1型鹵鎢燈和 USB2000+光纖光譜儀購(gòu)自美國(guó) Ocean Optics公司，45°/45°/90°玻璃棱鏡(n = 1.799@λ = 633 nm)定制于北京北東光電自動(dòng)化開(kāi)發(fā)公司，彩色CCD數(shù)字成像模塊(XSXS192)購(gòu)自深圳顯盛儀器有限公司，測(cè)角轉(zhuǎn)盤、光纖準(zhǔn)直器和線性偏振片購(gòu)自北京大恒光電技術(shù)公司，多模石英光纖來(lái)自浙江雷疇科技有限公司，用于注液的蠕動(dòng)泵購(gòu)自保定蘭格恒流泵有限公司，樣品槽及其夾具自制。

Kretschmann結(jié)構(gòu)多功能平臺(tái)如圖1所示，玻璃棱鏡固定于測(cè)角轉(zhuǎn)盤上，SPR傳感芯片的玻璃基底一側(cè)與棱鏡底面通過(guò)折射率匹配液緊密貼合，金銀合金薄膜暴露于樣品槽內(nèi)。鹵鎢燈發(fā)出的光依次通過(guò)多模石英光纖，光纖準(zhǔn)直器及線性偏振片后成為p偏振平行光束(發(fā)散角小于0.2°)。平行光束以角度θ從棱鏡一斜面射入棱鏡，并在SPR傳感芯片的玻璃/金屬界面上發(fā)生全反射，全反射導(dǎo)致的消逝場(chǎng)在金銀合金薄膜表面激勵(lì) SPP，使得從棱鏡另一斜面輸出的反射光受到 SPP的調(diào)制。反射光束射入顯微鏡筒后被筒內(nèi)設(shè)置的半透半反鏡分為兩束光，其中一束光被CCD成像模塊接收進(jìn)行SPP共振彩色圖像探測(cè)，另一束光經(jīng)透鏡聚焦于光纖端面，由光纖輸入至光譜儀進(jìn)行SPP共振光譜探測(cè)。SPP共振光譜探測(cè)的目的是為了建立共振彩像的色相參數(shù)與共振波長(zhǎng)之間的依賴關(guān)系。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

為了建立共振波長(zhǎng)與共振彩像的平均色相之間的依賴關(guān)系，超純水被注入樣品槽內(nèi)覆蓋金銀合金薄膜，將光譜儀積分時(shí)間設(shè)為50 ms，調(diào)節(jié)起始入射角θ，使得反射光度譜在580 nm附近出現(xiàn)SPP共振吸收谷，在此條件下采集反射光強(qiáng)度譜和SPP共振彩像。之后逐步手動(dòng)調(diào)節(jié)入射角，每次調(diào)節(jié)使得共振波長(zhǎng)紅移5 nm左右，在每次調(diào)節(jié)入射角前完成光譜和共振彩像的采集。從測(cè)得的反射光強(qiáng)度譜中得出SPP共振波長(zhǎng)，利用色相算法從測(cè)得的SPP共振彩像中求出平均色相，然后將同一入射角下獲得的共振波長(zhǎng)和平均色相組成數(shù)據(jù)對(duì)，建立兩者的對(duì)應(yīng)關(guān)系。在本工作中，每一幅共振圖像的大小為300 × 300像素，對(duì)應(yīng)的芯片面積約為0.5 mm2。

在折射率靈敏度測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，配制了質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.5%和2%的氯化鈉水溶液。利用阿貝折射儀測(cè)得各溶液的折射率分別為 1.3330、1.3333、1.3337、1.3341、1.3346、1.3355和1.3364。測(cè)試時(shí)首先將超純水注入樣品槽，調(diào)節(jié)入射角θ = 12°，對(duì)應(yīng)的起始共振波長(zhǎng)約為595 nm，完成SPP共振光譜和共振彩像采集后將樣品槽中的超純水更換為給定濃度的氯化鈉水溶液，再次采集SPP共振光譜和共振彩像，由此得出各個(gè) NaCl濃度對(duì)應(yīng)的共振波長(zhǎng)和圖像色相，進(jìn)而獲得金銀合金薄膜SPR傳感器的共振波長(zhǎng)和圖像色相對(duì)液體折射率的靈敏度。

圖1 寬光譜表面等離子體共振成像實(shí)驗(yàn)平臺(tái)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the laboratory-made spectral SPR imaging platform.

為了測(cè)試 SPRI傳感器對(duì)蛋白質(zhì)吸附的圖像響應(yīng)本領(lǐng)，利用超純水配制了濃度為10 μmol·L-1的牛血清蛋白(BSA)溶液作為待測(cè)樣品，在入射角θ = 12°的條件下采集完超純水對(duì)應(yīng)的共振光譜及共振彩像后，再將BSA溶液注入樣品槽，以1 min的時(shí)間間隔陸續(xù)采集SPP共振光譜和共振彩像，30 min后結(jié)束測(cè)試。

3 結(jié)果與討論

3.1 共振波長(zhǎng)與平均色相的依賴關(guān)系

圖2a顯示了在不同入射角度下測(cè)得的10個(gè)反射光強(qiáng)度譜，這些光譜被進(jìn)行了歸一化處理。每一個(gè)光譜包含一個(gè)又深又窄的波谷，該波谷是由金銀合金薄膜SPP的共振吸收導(dǎo)致的，谷底對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)就是SPP共振波長(zhǎng)。10個(gè)共振波長(zhǎng)從λR=578.9 nm逐漸增大至λR= 629.9 nm，變化量為51 nm，圖 2b顯示了實(shí)驗(yàn)記錄的 10個(gè) SPP共振彩像，每一個(gè)彩像對(duì)應(yīng)于圖2a中的一個(gè)光譜，可以看出共振彩像的顏色隨著共振波長(zhǎng)的移動(dòng)而變化。圖2b還給出了共振彩像經(jīng)過(guò)色相算法處理得出的二維色相分布。每一個(gè)二維色相分布由300 ×300個(gè)色相值組成，也就是說(shuō)共振彩像中的每一個(gè)像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)色相值，因此利用色相作為靈敏度參數(shù)，彩色SPRI傳感器能夠測(cè)量一個(gè)象素對(duì)應(yīng)的局域靈敏度。求取這些色相值的平均值就獲得了整個(gè)共振彩像的平均色相。圖2c顯示了共振彩像的平均色相與共振波長(zhǎng)的依賴關(guān)系。從圖中看出，平均色相值隨著共振波長(zhǎng)的紅移呈非線性上升趨勢(shì)；在594.9-610.2 nm波長(zhǎng)區(qū)間色相變化最快，由126.1線性增大至241.2，斜率為Δhue/Δλ =7.52 nm-1。這一斜率意味著以色相作為靈敏度參數(shù)，彩色SPRI傳感器的靈敏度比波長(zhǎng)檢測(cè)型SPR傳感器高7.5倍。因此，將594.9-610.2 nm波長(zhǎng)區(qū)間確定為色相敏感區(qū)間，可以使傳感器具有較高的色相靈敏度。值得強(qiáng)調(diào)的是，只要金銀合金薄膜SPR芯片參數(shù)給定，圖2c所示的平均色相與共振波長(zhǎng)的曲線關(guān)系不隨芯片的更換而發(fā)生變化。該結(jié)論已經(jīng)通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)測(cè)試得到確認(rèn)。

3.2 金銀合金薄膜SPRI傳感器的折射率靈敏度

圖2 不同入射角度下測(cè)得的(a)共振光譜和(b)共振彩像以及共振彩像的二維色相分布；(c)共振彩像的平均色相值與共振波長(zhǎng)的依賴關(guān)系Fig. 2 (a) Resonance spectra measured at different incident angles, (b) the corresponding resonance images and their 2D hue profiles; (c) relationship between the average hue and the resonance wavelength.

利用一系列濃度已知的 NaCl水溶液作為折射率液體，在入射角 θ = 12°下測(cè)試了 SPRI傳感器的共振波長(zhǎng)和共振彩像的色相參數(shù)對(duì)液體折射率的靈敏度。圖3a所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為不同濃度氯化鈉溶液的SPP共振彩像及其對(duì)應(yīng)的二維色相分布，圖中顯示，隨著NaCl水溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0%逐漸增加到2%，SPP共振彩像的顏色及對(duì)應(yīng)的二維色相分布逐漸發(fā)生變化。圖3b顯示了共振彩像的平均色相值與溶液折射率的依賴關(guān)系。從圖中可以得到，隨著氯化鈉溶液折射率逐漸增加，SPP共振彩像的平均色相從126.45上升至231.78，二者呈良好的線性關(guān)系，擬合度R2= 0.993，直線斜率代表 SPRI傳感器的色相參數(shù)對(duì)溶液折射率的靈敏度。該靈敏度為 Δhue/Δnc= 29879 RIU-1(Refractive Index Unit)。為了比較，在相同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)試了金膜 SPRI傳感器的平均色相對(duì)溶液折射率的靈敏度。設(shè)定起始共振波長(zhǎng)約為590 nm，測(cè)得的靈敏僅為Δhue/Δnc= 3658 RIU-1，比金銀合金薄膜SPRI傳感器的靈敏度低8倍多。

圖3 (a)不同濃度NaCl水溶液覆蓋金銀合金薄膜后測(cè)得的共振彩像以及計(jì)算得到的各彩像的二維色相分布；(b)平均色相與NaCl溶液折射率的依賴關(guān)系Fig. 3 (a) Resonance color images and the corresponding 2D hue profiles (images obtained after covering the goldsilver alloy film with different concentrations of aqueous NaCl solutions); (b) relationship between average hue and refractive index of aqueous NaCl solution.

實(shí)驗(yàn)還測(cè)試了金銀合金薄膜SPR芯片的共振波長(zhǎng)對(duì)液體折射率的靈敏度，并與基于色相的折射率靈敏度作了比較。圖4a給出了在入射角θ =12°下測(cè)得的金銀合金薄膜SPR傳感器對(duì)NaCl溶液折射率的光譜響應(yīng)結(jié)果。從圖中可知共振波谷隨著溶液折射率的增大逐漸紅移。如圖4b所示，共振波長(zhǎng)與溶液折射率呈良好的線性關(guān)系，斜率為ΔλR/Δn = 3897.6 nm·RIU-1。該斜率即為傳感器對(duì)折射率的光譜靈敏度，它比實(shí)驗(yàn)測(cè)得的基于色相的折射率靈敏度低7.67倍。這一比值與上述在色相敏感的光譜區(qū)間得到的直線斜率 Δhue/ΔλR=7.52 nm-1基本一致。

圖4 (a)不同濃度NaCl水溶液覆蓋金銀合金薄膜后測(cè)得的共振光譜，(b)共振波長(zhǎng)與NaCl溶液折射率的依賴關(guān)系Fig. 4 (a) Resonance spectra measured after covering the gold-silver alloy film with different concentrations of aqueous NaCl solutions; (b) relationship between resonance wavelength and refractive index of aqueous NaCl solution.

為了分析金銀合金 SPRI傳感器在現(xiàn)有條件下是否具有單像素定量生化探測(cè)本領(lǐng)，圖5a給了由超純水更換為1% (w，質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉溶液所導(dǎo)致的共振圖像中每一個(gè)像素的色相變化量。從該三維圖中可以看出幾乎所有像素的色相值都增大了，整個(gè)圖像(300 × 300 像素)的平均色相變化量為47.2。但是不同的像素，其色相變化量不同，變化量最小為1.03，最大為135.43，離散度較大。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)單像素點(diǎn)的色相與溶液折射率不滿足線性依賴關(guān)系，而且對(duì)于同一溶液折射率變化，單像素點(diǎn)的色相變化重復(fù)性較差，這就意味著在現(xiàn)有條件下，SPRI傳感器不具備單像素定量生化探測(cè)能力。通過(guò)分析數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)像素的平均色相隨溶液折射率的變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)像素點(diǎn)增大至6 × 6像素，其平均色相與溶液折射率呈較好的線性關(guān)系，如圖5b所示。上述分析結(jié)果指出在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下，金銀合金薄膜 SPRI傳感器能夠?qū)? × 6像素點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的微觀敏感區(qū)域進(jìn)行定量生化探測(cè)。

圖5 (a)由溶液折射率變化導(dǎo)致的共振圖像中任意像素點(diǎn)的色相變化量，(b) 6 × 6像素點(diǎn)的平均色相隨溶液折射率的線性變化關(guān)系Fig. 5 (a) A change of hue at each pixel in the resonant image caused by a change in the refractive index of the solution, (b) The relationship between the average hue for 6 × 6 pixels and the solution index of refraction.

3.3 金銀合金薄膜SPRI傳感器對(duì)蛋白質(zhì)分子吸附的響應(yīng)

利用BSA水溶液作為被測(cè)樣品，驗(yàn)證了SPRI傳感器對(duì)蛋白質(zhì)分子非特異性吸附的定量檢測(cè)本領(lǐng)。首先利用阿貝折射儀對(duì)所配制的10 μmol·L-1的BSA溶液的折射率進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明在測(cè)量精度范圍內(nèi)溶液折射率與超純水折射率相同，從而排除了在測(cè)試過(guò)程中溶液折射率對(duì)傳感器響應(yīng)的影響。圖 6a給出了在入射角 θ = 12°下，10 μmol·L-1BSA水溶液在吸附過(guò)程中的SPP共振彩像及其對(duì)應(yīng)的二維色相分布。相比于直接觀測(cè)SPR彩像的顏色變化，通過(guò)色相算法計(jì)算得到的圖像二維色相分布可以更直觀的反映外界折射率的改變情況。圖6b給出了SPP共振彩像的平均色相隨蛋白質(zhì)吸附時(shí)間的變化情況，吸附反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，共振彩像的平均色相為128.45，隨著B(niǎo)SA分子在傳感芯片表面的吸附量逐漸增加，共振彩像的平均色相也在逐漸增加，當(dāng)吸附進(jìn)行20 min時(shí)平均色相不再隨時(shí)間變化，其穩(wěn)定值為211.73。從吸附開(kāi)始至吸附停止，色相的變化量為 Δhue =83.28?？紤]到BSA分子在芯片表面的吸附最多只能形成一個(gè)完整的單分子層(即表面覆蓋度Γ = 1)，而在現(xiàn)有條件下 SPRI傳感器的平均色相測(cè)量誤差約為σ = 4，按照3σ準(zhǔn)則，傳感器能夠測(cè)得的BSA最小表面覆蓋度近似為0.14。

圖6 (a)在BSA吸附過(guò)程中測(cè)得的共振彩像以及彩像的二維色相分布，(b)共振彩像的平均色相與吸附時(shí)間的依賴關(guān)系Fig. 6 (a) SPR images corresponding to different adsorption time and two-dimensional hue profiles corresponding to different SPR images; (b) average hue versus adsorption time.

4 結(jié)論

本文報(bào)道的一種基于彩色圖像色相算法的寬光譜SPRI生化傳感器，它使用金銀合金薄膜制作SPR傳感芯片，具有時(shí)間分辨的圖像分析和微觀區(qū)域定量檢測(cè)本領(lǐng)。與傳統(tǒng)的金膜SPRI傳感器相比，金銀合金薄膜 SPRI傳感器具有檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)成本低的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，建立了金銀合金薄膜SPP共振彩像的平均色相與SPP共振波長(zhǎng)的依賴關(guān)系，確定了色相敏感的光譜區(qū)間為594.93-610.16 nm。實(shí)驗(yàn)獲得了金銀合金薄膜SPRI傳感器的平均色相對(duì)液體折射率的靈敏度為29879 RIU-1，比基于共振波長(zhǎng)的折射率靈敏度高7.5倍，并且顯著高于傳統(tǒng)的金膜SPRI傳感器的平均色相對(duì)液體折射率的靈敏度。本文進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了金銀合金薄膜 SPRI傳感器適用于對(duì)蛋白質(zhì)分子吸附過(guò)程的原位動(dòng)態(tài)檢測(cè)，能夠?qū)Ρ砻娓采w度小于5%的BSA吸附分子作出明顯響應(yīng)。本文研究結(jié)果指出這種基于金銀合金薄膜的寬光譜SPRI傳感器在生化物質(zhì)的原位非標(biāo)記檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。