合募配穴針刺對(duì)慢性酒精肝損傷大鼠模型的保護(hù)作用*

姜 陽,王朝輝,李 麗,穆雙雙,徐維茵,楊秀璐

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117)

中國(guó)酒文化深入人心，飲酒人數(shù)龐大，新生代成為酒類消費(fèi)的主力軍[1]，酒文化給我們帶來生活上的精彩時(shí)也給我們帶來一些負(fù)面效應(yīng)，飲酒不當(dāng)易造成肝損傷，并且酒精性肝病的患病率有上升趨勢(shì)[2-3]。慢性酒精性肝損傷初期通常分成以下幾個(gè)階段，脂肪肝階段、酒精性肝炎階段、肝纖維化和肝硬化階段[4]，而飲酒是肝性疾病變化發(fā)展的主要因素[5]。目前治療酒精肝以西藥為主，患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重并且西藥有一定副作用，所以推廣經(jīng)濟(jì)安全的方法具有實(shí)際意義，而針灸學(xué)在此方面有很大擴(kuò)展空間。

期門為肝經(jīng)募穴，足三里為胃經(jīng)下合穴，《金匱要略》中開篇提到:“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”。所以本次實(shí)驗(yàn)選用合募配穴治療大鼠酒精肝。筆者導(dǎo)師王朝輝教授進(jìn)行過相關(guān)腧穴配伍理論以及實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)合募配穴在防治臟腑病方面令人滿意[6]，其他研究者也有此發(fā)現(xiàn)[7-9]。本次試驗(yàn)通過觀察針刺酒精肝大鼠模型期門和足三里，探討合募配穴對(duì)酒精肝大鼠肝臟保護(hù)作用，為進(jìn)一步探討其機(jī)制提供理論準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠40只，2月齡，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～210 g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供。合格證號(hào)[SCXK(遼)2015-0001]。40只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組(A)、模型組(B)、針刺組(C)、陽性藥物組(D),每組10只。

1.2 主要試劑

測(cè)IV型膠原(IV-C)ELISA檢測(cè)試劑盒(南京建成科技有限公司,產(chǎn)品批號(hào)：20171207)、(HYP)ELISA檢測(cè)試劑盒(南京建成科技有限公司,批號(hào)：20171210)、蘇木精-伊紅染色液(南京建成科技有限公司,產(chǎn)品批號(hào)：20171105)、43°牛欄山二鍋頭白酒(北京順鑫股份有限公司,產(chǎn)品批號(hào)：20170418)、52°牛欄山二鍋頭白酒(北京順鑫股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào):20170108)、0.9%生理鹽水(山東科倫藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào):D160903082)和水飛薊賓(天津天士力圣特制藥有限公司,產(chǎn)品批號(hào)：750609060)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Rayto RT-6000酶標(biāo)儀(上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司)、TGL16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)、AUY220精密電子天平(日本島津公司)。

1.4 其他器材

華佗牌針灸針(規(guī)格：0.25×60 mm,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.5 大鼠造模

酒精灌胃法是一種常用的慢性肝損傷造模方法，造模成功率高，操作方便，應(yīng)用較廣泛[10-11]。B、C、D組大鼠適應(yīng)3天后開始灌胃造模，前16天為適應(yīng)性酒灌胃:前4天灌胃43°牛欄山二鍋頭，灌胃劑量為0.2 mL/20 g/d,分為早晚梯度灌胃;5～12天灌胃43°牛欄山二鍋頭，灌胃劑量為0.3 mL/20 g/d,分為早晚梯度灌胃;13～16天灌胃52°牛欄山二鍋頭，灌胃劑量為0.3 mL/20 g/d,分為早晚梯度灌胃。16天后灌胃52°牛欄山二鍋頭0.3 mL/20 g/d,造模4周。4周后進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，尾部取血，測(cè)ALT、AST,檢驗(yàn)造模是否成功。

1.6 干預(yù)方法

造模成功后針刺組(C)進(jìn)行針刺，模型組(B)只捆綁不針刺，空白組(A)不做任何處理，陽性藥物組(D)給予藥物進(jìn)行治療。陽性藥物組灌水飛薊賓生理鹽水溶液(1 mL/100 g/d)。針刺組依據(jù)《常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位定位圖譜》進(jìn)行穴位定位，足三里穴：腓骨小頭前下5 mm處;期門：第6肋間。取大鼠雙側(cè)穴位，常規(guī)消毒，毫針均內(nèi)下斜刺0.5～1 cm,留針60 s,治療4周。

1.7 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)方法

1.7.1 肝組織觀察 針刺4周后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，腹主動(dòng)脈取血，取臟器，測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。取大鼠肝組織經(jīng)10%中性緩沖甲醛液固定、取材、乙醇梯度脫水、石蠟包埋切片、蘇木精和伊紅染色(H&E)，在100倍光鏡下觀察。

1.7.2 血清學(xué)肝功能測(cè)定 取大鼠血液0.5 mL，放置在干燥玻璃管內(nèi)，37 ℃保溫30 min，4 ℃冰箱靜置2 h，2 000 min，離心10 min，取血清，-80 ℃保存，自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能指標(biāo)ALT和AST。

1.7.3 肝臟組織IV-C、HYP檢測(cè) 大鼠經(jīng)10%水合氯醛溶液(0.4 mL/100 g)麻醉后，腹主動(dòng)脈取血并提取血清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定血清中HYP、IV-C含量。

1.7.4 Western blot 將肝組織置于冰冷的裂解液收集裂解物總蛋白，組織蛋白行SDS-PAGE 并轉(zhuǎn)印至PVDF膜；室溫封閉2 h，與 TGF-β一抗孵育，膜經(jīng)漂洗后再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗反應(yīng)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑顯影，灰度成像軟件(UVP，UK)測(cè)定主帶的光密度值以計(jì)算TGF-β蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織觀察結(jié)果比較

A組光鏡下觀察，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完好，肝細(xì)胞內(nèi)未見明顯變性、壞死，肝竇未見明顯的淤血擴(kuò)張。B組肝臟病理組織損傷最為嚴(yán)重，肝細(xì)胞核膨化，C、D組肝組織病理形態(tài)均較B組有所減輕，肝組織均出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松等，少部分可見小灶性或單一細(xì)胞壞死，并伴隨有輕微的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

注：A空白組;B模型組;C針刺組;D陽性藥物組。圖1 各組大鼠肝組織HE染色比較(100×)

2.2 各組血清肝功能指標(biāo)水平比較

與空白組相比，模型組血清中ALT及AST水平顯著提升(P<0.01)；與模型組相比，治療后針刺組與陽性藥物組血清ALT及AST水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 血清中AST及ALT變化

注：與空白組比較，###P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

2.3 各組血清肝纖維化指標(biāo)水平比較

與空白組相比，模型組中肝組織IV-C、HYP水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療4周后相較于模型組，針刺組肝組織中IV-C、HYP水平均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 血清中IV-C和HYP變化

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.4 各組Western blot結(jié)果比較

2.4.1 各組肝組織中TGF-β蛋白表達(dá)結(jié)果比較 與空白組相比，模型組肝組織中TGF-β蛋白表達(dá)水平提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，治療后針刺組、陽性藥物組TGF-β蛋白表達(dá)結(jié)果水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 肝組織中TGF-β蛋白水平

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.4.2 各組TGF-β蛋白條帶結(jié)果比較 同空白組相比，模型組TGF-β蛋白表達(dá)有明顯提升；同模型組相比，針刺組，陽性藥物組TGF-β蛋白表達(dá)均有所下降。見圖2。

圖2 TGF-β蛋白條帶

3 討論

有研究表明慢性酒精肝的致病機(jī)理主要包括酒精代謝、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等[12]。連續(xù)給予酒精刺激可使肝細(xì)胞變性、壞死，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。此次試驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行酒精灌胃造模，模型組肝細(xì)胞核膨化，肝組織均出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松，切片結(jié)果顯示本次試驗(yàn)造模成功。對(duì)酒精肝大鼠進(jìn)行干預(yù)針刺，針刺后大鼠肝組織膨化減輕，肝細(xì)胞腫脹程度減輕，這說明合募配穴(足三里配期門)對(duì)大鼠肝臟具有保護(hù)作用。

ALT主要儲(chǔ)存于肝細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)，AST主要存在于肝臟組織中，當(dāng)肝功能異?；蚋谓M織損傷時(shí)，血清中ALT、AST水平會(huì)顯著提高。臨床上把ALT、AST作為評(píng)價(jià)肝功能正常與否的重要指標(biāo)之一[13-16]。本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，針刺足三里及期門穴后，慢性酒精肝大鼠血清中的ALT、AST水平顯著降低(P<0.01)。這說明針刺足三里、期門能夠在一定程度上保護(hù)肝功能，抑制肝損傷。

慢性酒精肝的一個(gè)重要病理過程是肝纖維化，一旦纖維化得不到控制便會(huì)發(fā)展為肝硬化[17]。肝纖維化的主要表現(xiàn)是以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量增生和沉積[18]。 肝組織中Hyp含量較穩(wěn)定,其在肝中的含量可反映膠原代謝的變化情況[19]。研究表明，IV-C是組成基底膜的主要成分, 在細(xì)胞分化和基因表達(dá)中扮演重要角色,因此IV型膠原(IV-C)也是反映肝纖維化程度的良好指標(biāo)[20]。此次實(shí)驗(yàn)中，針刺組中肝組織中IV-C、HYP水平均降低，這提示針刺足三里穴配期門穴能夠減緩肝纖維化進(jìn)程，進(jìn)而減輕肝損傷，起到保護(hù)肝臟的作用。

根據(jù)相關(guān)報(bào)道，星狀細(xì)胞(HSC)在肝損傷產(chǎn)生的炎癥因子、氧化重構(gòu)、脂質(zhì)過氧化、免疫應(yīng)答等刺激下，大量產(chǎn)生 TGF-β、CTGF等細(xì)胞炎性因子[21]。TGF-β/Smads信號(hào)通路是TGF-β下游經(jīng)典的信號(hào)通路[22]。TGF-β是促纖維化主要細(xì)胞因子之一，HSC的激活是一個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程，其過程對(duì)于TGF-β/Smads通路而言，TGF-β是啟動(dòng)因子[23]。TGF-β是Ⅰ型膠原基因轉(zhuǎn)錄刺激因子，當(dāng)TGF-β與其受體結(jié)合后激活 Smad-3并磷酸化，與 Smad-4形成異源三聚體復(fù)合物入核，與DNA 結(jié)合，調(diào)控Ⅰ型膠原基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)HSC合成Ⅰ型、Ш型、IV 型膠原等，最終提高HYP、IV等型膠原在肝組織中含量[24]，增加組織纖維化程度。本次實(shí)驗(yàn)TGF-β蛋白表達(dá)水平及條帶說明，針刺可降低大鼠肝組織中TGF-β蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制肝纖維化，依據(jù)本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推測(cè)，合募配穴針刺可能通過TGF-β/ Smads信號(hào)通路來抑制肝纖維化。

阻斷或逆轉(zhuǎn)慢性肝損傷中纖維化發(fā)生和發(fā)展是治療慢性肝病的關(guān)鍵，西醫(yī)對(duì)慢性肝損傷治療尚缺乏有效辦法。中醫(yī)對(duì)肝病的認(rèn)識(shí)歷史悠久，酒精肝在中醫(yī)的專業(yè)術(shù)語里稱為“酒疸”。中醫(yī)理論認(rèn)為,肝纖維化、肝硬變的重要原因是“久病入絡(luò)”。針灸能夠調(diào)暢氣血、疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和陰陽，恢復(fù)臟腑功能，并且不經(jīng)肝腎代謝，減輕肝腎負(fù)擔(dān)。期門穴乃肝經(jīng)募穴，是調(diào)理肝氣、調(diào)暢氣機(jī)之要穴[25]，足三里為胃經(jīng)下合穴，具有扶正祛邪、通降腑氣之功[26]，合募配穴，上下相應(yīng)，能增強(qiáng)穴位主治，擴(kuò)大治療范圍。本次實(shí)驗(yàn)表明,通過合理配穴針刺能夠在一定程度上減緩肝損傷，抑制肝纖維化，保護(hù)肝功能,為針刺治療肝臟病提供治療思路。