佛波醇制備工藝優(yōu)化及其衍生物的合成表征與細胞毒活性研究

李啟潤，張小強，崔新健，趙 磊，代昌平，蔣小崗，張 健

蘇州大學(xué)藥學(xué)院，蘇州 215123

佛波醇酯(phorbol ester)——二萜類化合物，廣泛存在于大戟科和瑞香科植物中，具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗HIV、抗炎、抗菌等[1-4]。其中，12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)在進行白血病治療的臨床II期試驗[5]，12-去氧佛波醇-13-乙酯(prostratin)在進行抗艾滋病(human immunodeficiency virus,HIV)的臨床I期試驗[6]。佛波醇酯化合物結(jié)構(gòu)相近，化合物的分離具有工作繁瑣、分離難度大、量微等缺點，這就對佛波醇酯的生物活性測試和構(gòu)效關(guān)系研究帶來困難；佛波醇酯生物活性多樣，但也具有一定的毒性，但其毒性與化合物結(jié)構(gòu)關(guān)系研究較少，本研究首先對巴豆油水解工藝進行優(yōu)化，制備佛波醇(phorbol)；并對其進行結(jié)構(gòu)修飾，以二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)為代表的長鏈不飽和脂肪酸和以花生酸為代表的長鏈飽和脂肪酸對佛波醇進行酯化反應(yīng)；考察了佛波醇酯化衍生物對人正常胚肺成纖維細胞(MRC-5)的毒性；實驗結(jié)果將為佛波醇酯類藥物制備提供參考。

1 試劑與方法

1.1 儀器與試劑

Rudolph AutopolII旋光儀；Bruker VERTEX 70紅外光譜儀；Shimadzu UV-2600紫外可見分光光度計；Agilent 1260高效液相色譜儀；Agilent 6540超高解析度四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀；Unity Inova 400、600MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀；TECAN INFINITE M1000多功能酶標(biāo)儀。

佛波醇(phorbol)和二十碳五烯酸(EPA)為實驗室自制，二十二碳六烯酸(購于MedChemExpress 公司)。其他試劑與溶劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 佛波醇制備工藝優(yōu)化

佛波醇制備工藝目前比較成熟[7,8]，但其制備周期需一周左右，為了縮短制備周期，本研究從水解時堿的濃度、水解時間、調(diào)節(jié)pH的節(jié)點、柱層析的選擇四個方面對制備過程進行優(yōu)化。

1.3 佛波醇衍生物合成線路

佛波醇結(jié)構(gòu)修飾過程主要包括羥基的選擇性保護、選擇性酯化、去保護等[9,10]。

圖1 佛波醇衍生物合成路線Fig.1 Synthesis of phorbol derivatives

1.4 化學(xué)合成

1.4.1 中間體(Z1、Z2)

參照文獻[9,11]制備得到中間體佛波醇-13，20-二乙酯(Z1)和佛波醇-20-三苯基甲醚(Z2)。

1H NMR (CDCl3,600 MHz)δ:7.56 (1H,s,H-1),5.66 (1H,m,H-7),4.45 (2H,m,H-20),3.98 (1H,d,J=9.8 Hz,H-12),3.20 (1H,s,H-8),3.12 (1H,s,H-10),2.51/2.38 (2H,dd,J=19.2 Hz,H-5),2.10 (3H,s,COCH3),2.04 (3H,s,COCH3),1.98 (1H,m,H-11),1.22 (3H,s,H-16),1.21 (3H,s,H-17),1.02 (1H,d,J=5.7 Hz,H-14),1.01 (1H,d,J=6.5 Hz,H-18)。(中間體Z1，白色固體，1.90 g，產(chǎn)率80%)。

1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:7.51 (1H,s,H-1),7.39 (6H,m,Tr),7.28 (6H,m,Tr),7.22 (3H,m,Tr),5.55 (1H,m,H-7),4.11 (1H,d,J=10.8 Hz,H-12),3.54 (2H,m,H-20),3.03 (1H,s,H-8),2.91 (1H,s,H-10),2.41/2.34 (2H,dd,J=19.2 Hz,H-5),1.85 (1H,m,H-11),1.73 (3H,m,H-19),1.27 (3H,s,H-16),1.14 (3H,s,H-17),1.00 (1H,d,J=6.2 Hz,H-18),0.76 (1H,d,J=5.2 Hz,H-14)。(中間體Z2，淡黃色固體，1.946 g，產(chǎn)率58%)。

1.4.2 佛波醇-12，13，20-三二十碳五烯酸酯(1)，佛波醇-13，20-二二十碳五烯酸酯(2)

在100 mL圓底燒瓶中投入佛波醇(150 mg，0.41 mmol)，二十碳五烯酸(457 mg，1.5 mmol)，DMAP(153 mg，1.23 mmol)和EDCI(485 mg，2.46 mmol)，用20 mL二氯甲烷溶解，室溫攪拌過夜。待反應(yīng)完畢，經(jīng)后處理用硅膠柱層析得產(chǎn)物1(石油醚∶乙酸乙酯 =20∶1，300 mg，60%)。

參照產(chǎn)物1的合成，不同的是所用原料、催化劑、反應(yīng)時間均減小一半，得產(chǎn)物2(石油醚∶乙酸乙酯 =5∶1，247 mg，68%)。

1.4.3 佛波醇-13-二十碳五烯酸酯(3)，佛波醇-13-花生酸酯(4)，佛波醇-13-二十二碳六烯酸酯(5)，佛波醇-12，13-二二十碳五烯酸酯(6)，佛波醇-12，13-二花生酸酯(7)

在100 mL圓底燒瓶中投入中間體Z2(200 mg，0.33 mmol)，二十碳五烯酸(150 mg，0.5 mmol)，DMAP(60 mg，0.5 mmol)和EDCI(190 mg，1 mmol)，用20 mL二氯甲烷溶解，室溫攪拌過夜。待反應(yīng)完畢，經(jīng)后處理用硅膠柱柱層析洗脫得粗品(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶1，174 mg，33.7%)，將粗品加入10 mL 0.35 %高氯酸甲醇溶液反應(yīng)60 min，加入適量NaHCO3中和反應(yīng)，回收溶劑。加入水和二氯甲烷分層，經(jīng)后處理用硅膠柱層析得產(chǎn)物3(石油醚∶乙酸乙酯 =1∶1，105 mg，80%)。

參照產(chǎn)物3的合成，得產(chǎn)物4(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶2，160 mg，88%)，產(chǎn)物5(石油醚∶乙酸乙酯 =1∶1，86mg，74%)，產(chǎn)物6(石油醚∶乙酸乙酯 =5∶1，180 mg，78%)和產(chǎn)物7(石油醚∶乙酸乙酯 =5∶1，200 mg，70%)。

1.4.4 12-O-二十碳五烯酰佛波醇-13-乙酯(8)，12-O-二十碳五烯酰佛波醇-13-丁酯(9)，12-O-二十二碳六烯酰佛波醇-13-乙酯(10)，12-O-二十二碳六烯酰佛波醇佛波醇-13-丁酯(11)

在100 mL圓底燒瓶中投入中間體Z1(216 mg，0.48 mmol)，參照產(chǎn)物1的合成得到12-O-二十碳五烯酰佛波醇-13，20-二乙酯(石油醚∶乙酸乙酯 =4∶1，250 mg，70%)，直接加入10 mL 0.35%高氯酸甲醇溶液水解12 h。參照產(chǎn)物3的后處理方法得到產(chǎn)物8(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶2，150 mg，64%)。

參照產(chǎn)物8的合成，得到產(chǎn)物9(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶2，95 mg，52%)，產(chǎn)物10(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶2，150 mg，79%)和產(chǎn)物11(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶2，78 mg，85%)。

1.4.5 佛波醇-12-二十碳五烯酸酯(12)，佛波醇-12-花生酸酯(13)，佛波醇-12-二十二碳六烯酸酯(14)

在100 mL圓底燒瓶中投入12-O-二十碳五烯酰佛波醇-13，20-二乙酯(550 mg，0.67 mmol)，10 mL 0.05 M氫氧化鉀甲醇溶液，室溫反應(yīng)60 min。待反應(yīng)完畢加入適量稀鹽酸中和反應(yīng)，回收溶劑，加入水和二氯甲烷分層。經(jīng)后處理用硅膠柱層析得到產(chǎn)物12(石油醚∶乙酸乙酯 =1∶1，340 mg，76%)。

參照產(chǎn)物12的合成，得到產(chǎn)物13(石油醚∶乙酸乙酯 =1∶1，200 mg，75%)和產(chǎn)物14(石油醚∶乙酸乙酯 =2∶3，203 mg，76%)。

1.4.6 12-O-二十碳五烯酰佛波醇-20-乙酯(15)，12-O-十四烷酰佛波醇-20-乙酯(16)，12-O-花生酰佛波醇-20-乙酯(17)，12-O-二十二碳六烯酰佛波醇-20-乙酯(18)

在100 mL圓底燒瓶中投入化合物12(290 mg，0.45 mmol)，乙酸酐(275 mg，2.7 mmol)和三乙胺(227 mg，2.25 mmol)，用20 mL二氯甲烷溶解，室溫反應(yīng)12 h。待反應(yīng)完畢，經(jīng)后處理用硅膠柱層析得到產(chǎn)物15(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶2，150 mg，48.7%)。

參照產(chǎn)物15的合成，得到產(chǎn)物16(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶1，156 mg，68%)，產(chǎn)物17(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶1，352 mg，84%)和產(chǎn)物18(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶1，100 mg，86%)。

1.5 對正常胚肺成纖維細胞的毒性測試

取對數(shù)生長期的正常胚肺成纖維細胞 (MRC-5，5 × 104/mL) 接種于96孔板，每孔100 μL細胞，培養(yǎng)24 h后進行藥物處理。藥物最小終濃度1 μmol/L，最大100 μmol/L，按等比設(shè)置5個濃度。每個濃度設(shè)置3個重復(fù)孔。給藥48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，并放置細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。最后用酶標(biāo)儀檢測每孔中的吸光度(450 nm)，并計算IC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 佛波醇水解工藝優(yōu)化結(jié)果

傳統(tǒng)的水解工藝以11.0 g氫氧化鋇溶于400 mL甲醇(2.75 mg/mL)，對100 mL巴豆油水解24h，此過程中并未對堿的濃度和水解時間進行考察。本研究在其他條件不變的情況下，將堿的濃度提高到4.13 mg/mL(1.5倍)、4.95 mg/mL(1.8倍)和5.50 mg/mL(2.0倍)分別對100 mL巴豆油進行水解，每2 h取一次樣對水解情況進行監(jiān)測，連續(xù)取7次樣，經(jīng)高效液相檢測佛波醇的含量。水解曲線見圖2。

如圖所示，佛波醇的含量大致是從增加到下降再到平衡的一個過程。堿的濃度為4.13 mg/mL時，佛波醇含量較低；堿的濃度為5.50 mg/mL時，佛波醇含量在2 h達到最高，但考慮到堿的濃度過高會破壞佛波醇母核，同時會產(chǎn)生大量粘稠物質(zhì)使攪拌停止，所以堿的濃度不宜過高。而堿的濃度為4.95 mg/mL時，佛波醇含量較高，水解時間較短，所以堿濃度最優(yōu)選擇是4.95 mg/mL。

圖2 佛波醇水解曲線Fig.2 Hydrolysis curve of phorbol

同時可見，攪拌6 h后佛波醇含量開始下降，所以選定6 h為終止時間。

傳統(tǒng)工藝水解完成后，未經(jīng)調(diào)節(jié)pH直接減壓旋蒸除去甲醇，但佛波醇長時間處于堿性條件下會發(fā)生構(gòu)型變化，由佛波醇轉(zhuǎn)化為異佛波醇[12]，所以水解完畢應(yīng)該立即調(diào)節(jié)pH至弱酸性，這在目前的水解工藝中被忽視。本研究將水解完畢的水解液分為等體積的兩份(各100 mL)，一份調(diào)節(jié)pH至弱酸性，一份未調(diào)節(jié)。經(jīng)減壓旋蒸除去甲醇，然后加入等體積水，分別取樣經(jīng)液相分析。分析結(jié)果見表1。

表1 調(diào)節(jié)pH至弱酸性對佛波醇和異佛波醇含量的影響Table 1 The effect of adjusting pH to weakly acidic on the concentration of phorbol and isophorbol

如表1所示，水解液調(diào)pH至弱酸性時，佛波醇含量較未調(diào)的高，同時異佛波醇含量較未調(diào)的低。說明提前調(diào)節(jié)pH，可有效防止佛波醇向異佛波醇轉(zhuǎn)化。

此外，不同于硅膠柱分離，本研究對佛波醇的分離純化采用減壓ODS柱，用15%～20%的甲醇水溶液沖洗10個柱體積即可富集大部分佛波醇(純度 > 90%)，產(chǎn)率1.2%左右。

今日下午二點出殯，葬送至小石川念速寺。但同寺在朱引內(nèi)(譯者注：日語，讀音：しゅびきうち，即政府規(guī)定的東京市區(qū))，埋葬被禁，故埋葬于近地同宗新福寺。與前年死去的花子和去年死去的岳母同處。法名命為文操。[注]中野實等翻刻：《加藤弘之日記——明治十一年一月-明治十三年》，《東京大學(xué)史紀(jì)要》第11號，1993年3月，第141頁。

水解工藝優(yōu)化的結(jié)果：氫氧化鋇的用量為文獻報道的1.8倍(4.95 mg/mL)；水解時間為6 h；水解完畢立即調(diào)pH至弱酸性；分離純化采用減壓ODS柱。整個制備周期可縮短至3天，能夠為佛波醇的結(jié)構(gòu)修飾快速提供原料。

2.2 化合物理化與波譜數(shù)據(jù)

化合物2無色油狀液體；[α]25 D 24 (c0.2,MeOH);UV (MeOH)λmax (log ε) 234 (3.80) nm；IR (KBr)λmax 3 414,2 961,1 711,1 653,1 628 cm-1;1H NMR (CDCl3,600 MHz)δ:7.58 (1H,s,H-1),5.68 (1H,m,H-7),5.42-5.30 (m,20H CH=CH×10),4.45 (2H,m,H-20),3.97 (1H,d,J=9.8 Hz,H-12),3.20 (1H,s,H-8),3.15 (1H,s,H-10),2.84-2.80 (m,16H,=CHCH2CH=×8),2.57/2.51 (2H,dd,J=19.3 Hz,H-5),2.37-2.31 (3H,t,J=7.6 Hz,4H,COCH2CH2×2),2.14-2.05 (8H,m,CH2CH2CH=×2 and =CHCH2CH3×2),1.99 (1H,m,H-11),1.78 (3H,m,H-19),1.73-1.67 (4H,m,COCH2CH2×2),1.25 (3H,s,H-16),1.22 (3H,s,H-17),1.06 (1H,d,J=6.4 Hz,H-18),1.02 (1H,d,J=5.5 Hz,H-14),0.97 (6H,t,J=7.6 Hz,CH2CH3×2)；13C NMR (CDCl3,151 MHz)δ:208.69,176.68,173.38,160.53,136.21,133.23,132.71,132.20,132.18,129.28,129.04,129.01,128.78,128.74,128.71,128.46,128.43,128.41,128.36,128.31,128.24 (2C),128.18,128.03,127.99,127.16,127.14,78.38,77.51,73.49,69.47,68.01,56.81,45.22,39.51,39.18,35.54,33.84,33.76,26.71 (2C),26.66,25.79 (6C),25.69 (2C),24.91,24.74,23.87,20.71 (2C),17.01,15.22,14.43 (2C),10.28;HR-ESI-MS:m/z955.606 8 [M+Na]+(Calcd 955.606 4)。

2.3 佛波醇衍生物對正常細胞的毒性研究

表2 佛波醇衍生物對正常細胞毒性結(jié)果Table 2 Results of cytotoxicity of phorbol derivatives (n

如表2所示，13個化合物毒性較高(IC50< 38.12 μmol/L)，5個化合物毒性較低(IC50> 100 μmol/L)。佛波醇與長鏈飽和、不飽和脂肪酸形成三酯、二酯衍生物時，毒性較低(化合物1，6和7，IC50> 100 μmol/L)；佛波醇的13位羥基成乙酯或丁酯，12位羥基與長鏈不飽和脂肪酸成酯時毒性較高(化合物8，9，10和11的IC508.10 → 16.15 μmol/L)；佛波醇13位羥基與長鏈不飽和脂肪酸成單酯時毒性較大(化合物3和5的 IC50分別為26.97 μmol/L 和7.40 μmol/L)，與長鏈飽和脂肪酸成單酯時毒性較小(化合物4，IC50> 100 μmol/L)；佛波醇12位羥基形成單酯化衍生物與佛波醇13位羥基形成單酯化衍生物的結(jié)果類似(化合物12和14的 IC50分別為5.39 μmol/L和1.52 μmol/L，而化合物13的 IC50> 100 μmol/L)；佛波醇-12，20-二酯化衍生物普遍具有細胞毒性(化合物15，16，17和18的IC505.01 → 38.12 μmol/L)。

3 結(jié)論

本研究對佛波醇制備工藝進行優(yōu)化，使制備周期縮短至3天，可快速獲得佛波醇；對佛波醇進行結(jié)構(gòu)修飾，合成了18個新化合物，包括佛波醇單酯、二酯、三酯化衍生物；考察了佛波醇衍生物對正常細胞的毒性，結(jié)果表明：長鏈不飽和脂肪酸(EPA，DHA)的引入使大部分衍生物具有毒性，以佛波醇酯作為抗腫瘤藥物開發(fā)時，應(yīng)該避免引入長鏈不飽和脂肪酸；佛波醇-12，20-二酯化衍生物同樣具有毒性，在佛波醇結(jié)構(gòu)修飾時應(yīng)該避免合成這類產(chǎn)物；而佛波醇12位羥基、13位羥基分別與長鏈飽和脂肪酸形成單酯時毒性較低。實驗結(jié)果可為佛波醇的結(jié)構(gòu)修飾提供參考。