UPLC-QTOF/MSE聯(lián)合UNIFI篩選平臺快速分析牛膝中三萜皂苷類成分

傅 俊，吳 歡，吳 虹*

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230012；2新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，合肥 230038

牛膝始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為莧科植物牛膝(AchyranthesbidentateBl.)的干燥根，具有逐瘀通經(jīng)、補肝腎、強筋骨、利尿通淋、引血下行的作用。研究表明[1]，牛膝中包含多種結(jié)構(gòu)類型的化學(xué)成分，包括三萜皂苷類、植物甾酮類以及多糖等成分，其中三萜皂苷類成分是牛膝中的主要活性物質(zhì)，具有抗炎鎮(zhèn)痛，調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤作用[2，3]。目前，關(guān)于牛膝三萜皂苷的定性研究較少，缺乏系統(tǒng)性研究。

近年來，超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF/MS)以其高分離度、高靈敏度及高分辨率等特點廣泛應(yīng)用于中藥成分定性分析，血清藥物化學(xué)以及代謝組學(xué)等各個領(lǐng)域[4-7]。UNIFI[8，9]作為一個強大的信息處理平臺，可以對樣品的MSE數(shù)據(jù)自動進行離子流提取、分子式確定，同時與數(shù)據(jù)庫中化合物進行比對，并根據(jù)高能量下化合物的碎片信息給出化合物可能的裂解方式，最后在預(yù)設(shè)的過濾條件下顯示所鑒定化合物的詳細信息。最終，本實驗采用UPLC-QTOF/MSE結(jié)合UNIFI平臺，對牛膝中40種三萜皂苷進行了快速、全面的定性分析，為牛膝三萜皂苷質(zhì)量控制提供參考，同時為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的進一步研究提供參考。

1 實驗材料

Xevo G2-XS QTOF/MS、Masslynx V4.1工作站、UNIFI科學(xué)信息學(xué)系統(tǒng)(美國Waters公司)；ADW-1002-B型超純水機(美國Aquapro公司)；KQ-200KDB型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CP225D型電子天平(德國Sartorius公司)；色譜級甲酸(Fisher Scientific公司)；色譜級乙腈、甲醇(美國TEDIA公司)。

竹節(jié)參IVa(批號：CHB170227)純度≥98%，竹節(jié)參皂苷IV(批號：CHB180524)純度≥98%，人參皂苷Ro(批號：CHB170310)純度≥98%，購于成都克洛瑪生物科技有限公司。本實驗所用牛膝藥材(AchyranthesbidentateBl.)購自河南焦作市，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉勁松教授鑒定為懷牛膝。

2 實驗方法

2.1 樣品溶液制備

取牛膝飲片適量，粉粹成細粉，稱取粉末100 g，加入1 L乙醇加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，水浴濃縮浸膏至無醇味，加入蒸餾水定容至1 L，超聲30 min后，抽濾，量取續(xù)濾液150 mL過D101型大孔吸附樹脂柱，先用600 mL蒸餾水洗脫水溶性雜質(zhì)，最后用600 mL 70 %乙醇洗脫，收集洗脫液，干燥至恒重。精密稱定干燥粉末，加甲醇配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL溶液。同時制備空白對照樣品。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱定竹節(jié)參皂苷IVa，竹節(jié)參皂苷IV，人參皂苷Ro適量，加甲醇定量至容量瓶，配成濃度為1 mg/mL的溶液。置于4oC冰箱備用， 0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣。

2.3 色譜條件

Phenomenex C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm,1.6 μm)，流動相為0.1%甲酸水(A)—乙腈(B)，梯度洗脫：0～10 min，5%～30% B；10～11 min，30% B；11～12 min，30%～45% B；12～12.5 min，45%～47% B；12.5～15 min，47%～48% B；15～16 min，48%～50% B；16～19 min，50%～70% B；19～22 min，70%～85% B；22～24 min，85%～95% B；24～27 min，95% B；27～28 min，95%～5% B；28～30 min，5% B，流速0.2 μL/min，柱溫30oC，進樣量2 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，負離子模式掃描：掃描范圍m/z50～1 200，毛細管電壓2.5 kV，錐孔電壓40 V，錐孔氣流速50 L/h，離子源溫度120oC，脫溶劑氣(N2)流速600 L/h，脫溶劑氣溫度350oC。亮氨酸-腦啡肽[M-H]-=554.262 0作為LockSpray校準液(200 pg/mL)，流速10 μL/min，甲酸鈉溶液用來儀器校正。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法

為了便于對牛膝中三萜皂苷進行系統(tǒng)定性的分析，本實驗首先對已有對照品進行質(zhì)譜分析，總結(jié)出其色譜保留行為、裂解規(guī)律以及特征離子等。通過相關(guān)文獻的查詢以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(Chemspider，Mass Bank，SCIfinder等)建立UNIFI數(shù)據(jù)庫，并根據(jù)皂苷母核上取代基的數(shù)量將牛膝三萜皂苷分為單取代類和雙取代類化合物。再以UPLC-QTOF/MSE采集供試品數(shù)據(jù)。將MSE原始文件導(dǎo)入UNIFI平臺，建立UNIFI篩選方法(對于2D檢測最小峰面積設(shè)為200；3D檢測中，低能量下的峰強度設(shè)為500，高能量峰強度為150；誤差范圍±5 ppm，負離子下加和的離子為+HCOO和-H)，對化合物進行自動識別。

3 結(jié)果與分析

3.1 牛膝三萜皂苷對照品UPLC-QTOF/MSE裂解規(guī)律解析

如圖1所示，3種牛膝三萜皂苷對照品均在MSE低能量(6 V)下給出[M-H]-，而且都有一個特征的[M+HCOOH-2H]2-離子，該結(jié)果與文獻報道一致[9]。MSE高能量下(80～100 V)，對照品傾向于先丟失C28位上的糖基，這可能是由于C28位酯鍵比C3位的醚鍵更易斷裂，當五碳糖與六碳糖同時存在時，五碳糖優(yōu)先于六碳糖丟失。三個對照品都有齊墩果酸母核的特征碎片離子m/z455.350 8，但未見齊墩果酸母核繼續(xù)裂解而產(chǎn)生的碎片離子；同時可見C3位的葡萄糖醛酸(GluA)的準分子離子為m/z175.02 [GluA-H]-，其碎片離子為157.01 [GluA-H-H2O]-和113.02 [Glu-H-H2O-CO2]-；C28位的葡萄糖(Glu)的準分子離子為m/z179.05 [Glu-H]-，碎片離子為161.04 [Glu-H2O-H]-、143.03[Glu-H2O-H2O-H]-、131.03 [Glu-H2O-CH2O-H]-、119.03 [Glu-H2O-C2H2O-H]-以及113.02 [Glu-H2O-CH2O-H2O-H]-。

圖1 3種牛膝三萜皂苷對照品在MSE模式下低能量(1)與高能量(2)質(zhì)譜圖Fig.1 Low energy (1) and high energy (2) mass spectra of three reference standard of Achyranthes bidentata in MSE mode

3.2 牛膝樣品的UPLC-QTOF/MSE分析鑒定

牛膝皂苷提取物總離子流圖如圖2所示，結(jié)果共鑒定出40種三萜皂苷。其中在齊墩果酸母核上C3或C28僅有一個取代基的化合物13種，C3和C28位均有取代基的化合物25種，另有其它母核的三萜皂苷化合物2種。化合物保留時間、準分子離子及碎片離子信息詳見表1。

3.2.1 齊墩果酸型單取代三萜皂苷化合物的鑒定

單取代化合物指齊墩果酸母核上C3或C28位只有一個取代基的化合物，本實驗共鑒定出13種齊墩果酸型單取代三萜皂苷化合物。以峰25、27、35和36為例闡述其鑒定過程。峰25給出其[M-H]-為m/z793.437 6，通過MassLynx分析其分子式為C42H66O14，其在高能量下主要的特征碎片離子為m/z631.385 0 [M -Glu-H]-、613.374 2 [M-Glu-H2O-H]-、455.350 8 [M-Glu-GluA-H]-，通過與UNIFI鑒定結(jié)果相比對，推測其為姜狀三七苷R1。峰27在低能量下給出m/z763.435 4 [M-H]-的母離子，與竹節(jié)參皂苷IV相比分子量少了162，推測其分子式為C41H64O13，高能量下特征碎片離子為m/z631.385 6 [M-Arabinose(Ara)-H]-、613.373 0 [M-Ara-H2O-H]-、455.352 6 [M-Ara-GluA-H]-，其中m/z631.385 6、613.373 0、455.352 6分別與竹節(jié)參皂苷IV的碎片離子相同，峰27鑒定為28-去葡萄糖竹節(jié)參皂苷IV。峰35在低能量下給出m/z617.405 1 [M-H]-的離子峰，峰36給出m/z663.411 7 [M+HCOO]—，二者在高能量下都產(chǎn)生了相同的碎片離子m/z455.35 [M-H-Glu]—，通過比對文獻[10]，分別推測為3-O-β-D-葡萄糖基齊墩果酸苷和竹節(jié)參皂苷1。

圖2 空白溶液(A)與牛膝樣品(B)的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms (TIC) of blank solution (A) and Achyranthes bidentata sample (B)

表1 牛膝中三萜皂苷的UPLC-QTOF/MSE色譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 The chromatographic and mass spectrometric data of triterpene saponins identified from AB using UPLC-QTOF/MSE

續(xù)表1(Continued Tab.1)

峰號No.分子式Formula[M-H]—[M+HCOO]—偏差Error(ppm)保留時間tR(min)碎片離子Fragmentation ions鑒定化合物Identified compounds10C53H82O251 117.512 53.011.181 117.512 5,997.502 5,955.491 2,793.437 3,731.437 3,631.210 6,613.377 6,581.250 9,455.352 0,161.008 9Achyranthoside D11C48H76O19955.497 11.511.24955.452 2,793.440 8,731.439 0,631.384 5,613.374 7,569.385 9,455.350 8,157.013 5Ginsenoside Ro12C47H74O21973.461 8-3.311.49973.461 8,811.415 8,648.354 3,472.312 6β-D-glucopyranosyl 3β-[O-α-L-galactopyranosyl-(1→2)-O-α-D-glucopyranurono-syloxy] machaerinate13C47H74O18925.481 61.511.74925.481 6,793.434 4,631.386 5,613.369 6,455.350 8,157.013 6Chikusetsusaponin IV14C54H84O251 131.525 82.612.141 131.525 8,969.466 3,954.443 7,631.385 0,793.543 9,455.352 7,157.013 9Achyranthoside D methyl es-ter15C47H70O23S1 033.392 7-2.814.051 033.392 7,953.440 8,763.425 7,613.374 1,569.384 6,455.352 6,157.013 6Sulfachyranthoside B16C47H72O20955.456 42.114.24955.456 4,793.437 3,631.384 3,613.374 3,455.352 6,175.024 9 Achyranthoside C17C48H76O18985.502 92.614.31985.502 9,777.440 2,615.388 8,455.351 6Momordin Iia18C47H70O20953.439 40.714.48953.439 4,793.437 1,631.385 0,613.374 3,455.352 7,161.009 1Achyranthoside B or Bident-atoside I19C47H72O20955.45450.115.07955.454 5,835.443 9,793.436 7,613.374 1,455.351 8,161.008 8Achyranthoside G20C48H72O20967.451 9-2.615.18967.451 9,792.394 8,632.386 3,455.351 6,161.008 3Achyranthoside A21C49H78O191 015.512 11.315.501 015.512 1,789.439 0,627.386 8,455.351 8Chikusetsusaponin V methyl ester22C49H76O20983.484 6-1.115.68983.484 6,793.435 9,455.352 0,175.024 4,113.024 2Achyranthoside C dimethyl ester23C48H74O19953.472 8-2.516.06953.440 8,791.416 4,629.367 7,569.386 4,455.352 6Achyranthoside E dimethyl ester24C47H74O18925.472 3-.8.016.31925.472 3,793.436 6,631.384 0,455.352 1Pseudoginsenoside RT1

續(xù)表1(Continued Tab.1)

峰號No.分子式Formula[M-H]—[M+HCOO]—偏差Error(ppm)保留時間tR(min)碎片離子Fragmentation ions鑒定化合物Identified compounds25C42H66O14793.437 6-0.516.42793.437 6,631.385 0,613.374 2,455.350 8,157.013 2,113.024 0Zingibroside R126C47H70O20953.440 11.417.30835.448 0,793.437 3,613.374 2,455.352 5,161.008 8Bidentatoside I or Achyran-thoside B27C41H64O13763.435 40.917.50763.435 4,631.385 6,613.373 0,455.352 6,175.024 628-Desglucosylchikusetsusa-ponin IV28C41H62O15793.397 9-4.718.22793.397 9,631.385 5,455.352 9,161.008 928-deglucosyl-achyrantho-side C29C42H66O14793.440 22.718.49793.440 2,631.384 6,613.374 7,569.385 9,455.350 8,175.024 7,113.024 6Chikusetsusaponin Iva30C43H68O14853.459 90.818.42853.459 9,645.367 9,455.352 7,113.024 1Chikusetsusaponin Iva meth-yl ester31C41H60O15791.386 10.318.73791.386 7,631.385 2,613.374 2,455.352 8,175.024 4,113.024 1Achyranthoside iv32C36H58O9679.404 3-1.318.89679.404 3,471.346 4Hederagenin-28-O-β-D-glu-copyranosyl ester33C40H60O14763.391 50.719.17763.391 5,631.383 4,455.352 7,130.998 428-deglucosyl-achyrantho-side E34C36H56O9631.383 7-2.3719.48631.383 7,455.350 9,175.024 428-Desglucosylchikusetsusa-ponin IVa35C36H58O8617.405 1-1.319.73617.405 1,455.353 4,113.024 3Oleanolic acid 3-O-β-D-glu-copyranoside 36C36H58O8663.411 70.419.91663.411 7,455.352 9,161.045 1Chikusetsusaponin-137C53H82O28S1 197.259 421.401 197.259 4,1117.504 2,955.483 4,79.394 7,631.113 7,455.352 6,175.024 1Sulfachyranthoside D38C37H60O9633.399 9-1.422.09633.399 9,455.352 6,113.024 1Oleanolic acid 3-O-β-D-glu-copyranoside-6-O-methyl es-ter39C46H74O14895.509 51.622.51895.509 5,687.443 5,455.351 7,161.046 5Chikusetsusaponin Iva butyl ester40C41H62O14777.404 9-2.322.62777.404 9,631.384 6,613.373 0,455.351 5,175.024 33-O-β-D-Glc-(1→2)-[[2-carboxy-1-(carboxymethyl)-2-hydroxyethyl-(1→3)]-β-D-GluA oleanolic acid

3.2.2 齊墩果酸型雙取代三萜皂苷化合物的鑒定

雙取代化合物指齊墩果酸母核的C3和C28位上同時具有取代基的化合物，本實驗共鑒定出25種雙取代化合物?，F(xiàn)以峰10和峰24為例，闡述雙取代化合物鑒定過程。峰10在低能量下給出一個 [M-H]-m/z1 117.512 5以及[M+HCOOH-2H]2-m/z581.250 9，高能量下主要特征碎片離子m/z955.491 8 [M-H-C5H7O6]-、793.437 9 [M-H-C5H7O6-Glu]-、631.384 4 [M-H-C5H7O6-2Glu]-和455.353 1 [M-H-C5H7O6-2Glu-GluA]-(如圖3)，可推測該化合物為牛膝皂苷D，其可能裂解途徑如圖4所示。峰24在低能量下給出一個[M-H]-m/z925.472 3 以及[M+HCOOH-2H]2-m/z485.238 5，高能量下產(chǎn)生的碎片離子m/z793.436 6 [M-H-xylose(Xyl)]-、631.384 0 [M-H-Xyl-Glu]-、455.352 1 [M-H-Xyl-Glu-GluA]-，結(jié)合文獻報道[11]，將其鑒定為假人參皂苷RT1。

此外，本實驗通過UNIFI自建數(shù)據(jù)庫以及在線數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，峰12和峰32與上述三萜皂苷具有相同質(zhì)譜行為，但碎片離子中并未發(fā)現(xiàn)齊墩果酸母核455.35的碎片離子，通過軟件自帶元素分析功能確定分子式以及在線數(shù)據(jù)庫確定可能結(jié)構(gòu)，最終峰12和32分別被推測為β-D-glucopyranosyl 3β-[O-α-L-galactopyranosyl-(1→2)-O-α-D-glucopyranuronosyloxy] machaerinate和hederagenin-28-O-β-D-glucopyranosyl ester，兩者均為非齊墩果酸型三萜皂苷。

4 討論

本實驗通過UPLC-QTOF/MSE技術(shù)結(jié)合UNIFI平臺對牛膝中的三萜皂苷進行了快速的分析。在MSE模式下高、低能量動態(tài)變化的碰撞誘導(dǎo)解離過程中，可以實現(xiàn)一次進樣即可同時獲得化合物的準分子離子峰及相關(guān)碎片信息[12]。為了獲取三萜皂苷豐富的離子信息，更為全面的推測化合物的結(jié)構(gòu)，本實驗比較了正、負離子兩種質(zhì)譜掃描模式，結(jié)果顯示三萜皂苷在負離子模式下質(zhì)譜響應(yīng)較好，故最終確定為負離子模式下進行分析。同時本實驗考察了水-乙腈以及0.1%甲酸水-乙腈不同流動相對色譜峰的影響。最終采用了能有效改善峰形和離子化效果的0.1%甲酸水作為水相。此外，UNIFI平臺，可以按預(yù)設(shè)參數(shù)，進行成分的自動解析，并給出可能的裂解過程，極大的簡化了分析過程。本實驗根據(jù)對照品的裂解規(guī)律以及相關(guān)文獻，結(jié)合樣品在MSE模式下的精密分子質(zhì)量、碎片離子以及保留時間等信息，通過UNIFI平臺進行UNIFI自帶數(shù)據(jù)庫、自建數(shù)據(jù)庫以及在線數(shù)據(jù)庫(Chemspider,MassBank等)的檢索比對并利用MassLynx工作站進行人工核對。共鑒定了40種三萜類皂苷類成分，其中在齊墩果酸母核上C3或C28僅有一個取代基的化合物13種，C3和C28位均有取代基的化合物25種，另有其它母核的化合物2種。

圖3 牛膝皂苷D的UNIFI結(jié)果報告圖：提取 離子流圖(A)，低能量(B)及高能量質(zhì)譜圖(C)Fig.3 UNIFI results of Achyranthoside D: Extract ion chromatograms (A),low energy (B) and high energy (C) mass spectrometry

圖4 牛膝皂苷D可能裂解途徑Fig.4 Possible fragmentation pathways of Achyranthoside D

另外，本實驗發(fā)現(xiàn)齊墩果酸型三萜皂苷在負離子模式下存在一定的規(guī)律性：當C3位有取代基時會產(chǎn)生一個[M-H]-的準分子離子峰，但當單取代在C28位時，會產(chǎn)生一個[M+HCOO]-的準分子離子峰；當C3和C28位均有取代基時，C28位的取代基優(yōu)于C3位取代基先脫去，五碳糖(Ara,Xyl)優(yōu)于六碳糖(Glu)脫去。此外，當C3和C28位均有取代基時，除了會產(chǎn)生一個[M-H]-的準分子離子峰外，還會產(chǎn)生一個特征的[M+HCOOH-2H]2-分子離子峰。

總之，UPLC-QTOF/MSE以其高靈敏、高分辨率的特點結(jié)合UNIFI強大的數(shù)據(jù)處理能力能快速為牛膝中的三萜皂苷作定性分析，為中藥有效成分的鑒定提供了參考，同時也為牛膝皂苷的藥效物質(zhì)、質(zhì)量控制研究提供科學(xué)依據(jù)。