羊角天麻化學(xué)成分及β-羥高鐵血紅素形成抑制活性研究

沈 怡，陳 浩，崔淑君，肖朝江，董 相，姜 北

大理大學(xué)藥物研究所 大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，大理 671000

羊角天麻(Dobineadelavayi)為漆樹科(Anacardiaceae)(或 九子母科Podoaceae)九子母屬(Dobinea)植物，多年生亞灌木狀草本，根狀莖粗大，因炮制后形如羊角而得名；產(chǎn)云南(中部至西北部)、四川(西南部)；生于海拔1 100～2 300米的向陽(yáng)草坡或灌叢中[1]。民間用于肺熱咳嗽、跌打損傷、骨折以及治療腮腺炎、乳腺炎、瘡癤、頭暈、風(fēng)濕等，有消炎止痛、舒筋活絡(luò)之效[1,2]。

目前，僅有少量羊角天麻化學(xué)成分方面的研究報(bào)道[3-5]，從中分離得到了一系列單體成分，包括萜類、甾體、脂肪酸及甘油酯類成分。在本研究組前期開展滇西藥用植物活性篩選研究中，發(fā)現(xiàn)羊角天麻提取物具有較好的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性(IC50為239.6±20.7 μg/mL)。為進(jìn)一步明確該植物相關(guān)活性成分，本實(shí)驗(yàn)對(duì)采自云南大理的羊角天麻進(jìn)行了深入的化學(xué)成分研究，分離得到了12個(gè)化合物，分別鑒定為3,4,2′,4′-四羥基二氫查爾酮(1)、紫鉚花素(2)、3,4,2′,4′,α-五羥基查爾酮(3)、金色草素(4)、芒果苷(5)、沒食子酸(6)、二十四亞甲基環(huán)阿爾廷醇(7)、豆甾-4-烯-6β-羥基-3-酮(8)、β-谷甾醇(9)、胡蘿卜苷(10)、棕櫚酸甲酯(11)、1-棕櫚酸單甘油酯(12)，其中化合物1～4、6～8均為首次九子母屬植物中分離得到，明確了羊角天麻中查爾酮類成分的存在。活性檢測(cè)結(jié)果顯示，化合物1～6均具β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，其中黃酮類化合物2～4的抑制活性較好，其IC50分別為120.3、61.5、56.0 μg/mL，應(yīng)該是該植物β-羥高鐵血紅素形成抑制主要活性成分。

1 儀器與材料

Bruker Avance Ⅲ-400核磁共振儀(德國(guó)布魯克公司)，(TMS為內(nèi)標(biāo))；Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜儀及Bruker Daltonics MS質(zhì)譜系統(tǒng)；VARIOSKAN LUX多功能酶標(biāo)儀(Thermo fisher scientific)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、氯喹二磷酸鹽(美國(guó)Sigma公司)；氯高鐵血紅素(Solarbio公司)；氫氧化鈉(西隴化工股份有限公司)；乙酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；冰醋酸(廣東光華科技股份有限公司)；吡啶(上海申博化工有限公司)；二甲基亞砜(天津化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、丙酮、氯仿等試劑均為工業(yè)級(jí)有機(jī)溶劑均重蒸后使用；其余試劑均為分析純。

本實(shí)驗(yàn)所用植物樣品于2017年7月采自云南省大理蒼山西坡，經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥學(xué)教研室張德全博士鑒定為羊角天麻Dobineadelavayi(Baill.) Baill.，植物標(biāo)本(編號(hào)20170730-7)保存于大理大學(xué)藥物研究所姜北教授課題組。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取與分離

羊角天麻干燥根粉末1.9 kg，80%乙醇冷浸6次，每次24 h，合并冷浸液，減壓回收溶劑，濃縮后得總浸膏用適量水分散后，依次用乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行分配，得相應(yīng)萃取部位。乙酸乙酯部位(134.5 g)經(jīng)300～400目硅膠柱色譜分離，氯仿-丙酮混合溶劑洗脫，洗脫梯度為1∶0、9∶1、8∶2、6∶4、1∶1、0∶1，各梯度溶劑用量為：前三段分別為20 L左右，后三段分別為10 L左右，接樣量為每次1 L，通過薄層色譜檢測(cè)，合并得到8個(gè)流分Frs.1～8。

Fr.1經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜、Sephadex LH-20(丙酮)分離得化合物7(11.5 mg)、11(93 mg)；Fr.2經(jīng)硅膠柱色譜分離(石油醚-丙酮30∶1→0∶1)，并結(jié)合重結(jié)晶等方法得化合物9(11 mg)、12(35.4 mg)；Fr.3經(jīng)硅膠柱色譜(石油醚-丙酮)分離，F(xiàn)rs.3-4有晶體析出，經(jīng)有機(jī)溶劑反復(fù)洗滌得化合物8(6 mg)；Fr.4經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜(石油醚-丙酮4∶1、石油醚-乙酸乙酯4∶1)、Sephadex LH-20(丙酮)分離得化合物1(70 mg)；Fr.4經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜(石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮)方法得化合物2(36 mg)、3(7.8 mg)；Fr.5經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜(氯仿-丙酮、氯仿-甲醇)、重結(jié)晶方法得化合物4(16 mg)、6(6.8 mg)；Fr.6經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇30∶1→5∶1)Frs.6-7靜置后有沉淀析出，經(jīng)有機(jī)溶劑反復(fù)洗滌得化合物10(450 mg)，F(xiàn)rs.6-10靜置后有沉淀析出，經(jīng)有機(jī)溶劑反復(fù)洗滌得化合物5(17 mg)。

2.2 β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測(cè)

β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測(cè)試方法參照文獻(xiàn)[6-8]，并進(jìn)行適當(dāng)改良后按照如下操作進(jìn)行：精密稱取供試樣品并配成系列濃度溶液備用；精密稱量羥高鐵血紅素，以氫氧化鈉水溶液(濃度為0.1 mol/L)溶解，并定容至100 mL后避光保存?zhèn)溆?羥高鐵血紅素儲(chǔ)備液濃度1.0 mmol/L)。將50 μL不同濃度的供試樣品加入于96孔板中，平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；設(shè)置氯喹為陽(yáng)性對(duì)照，二甲基亞砜為空白對(duì)照，隨后每孔加入50 μL羥高鐵血紅素儲(chǔ)備液再加入80 μL醋酸鹽緩沖液(4 mol/L，pH5.0)使之混合。置于50 ℃孵育12 h，取出待室溫后，每孔加入100 μL 30%(v/v)的吡啶-HEPES(20 mmol/L，pH7.5)溶液。室溫靜置10 h后，從每孔中移取50 μL上清液至另一96孔板中，隨后每孔均加入200 μL吡啶-HEPES(20 mol/L，pH7.5)溶液，并在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值。由羥高鐵血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線得出未反應(yīng)的羥高鐵血紅素的濃度，從而計(jì)算出供試品對(duì)β-羥高鐵血紅素形成的半數(shù)抑制濃度(以IC50表示)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1淡黃色固體(丙酮);1H NMR (400 MHz,CD3COCD3)δ:12.85 (1H,s,2′-OH),7.74 (1H,d,J= 8.9 Hz,H-6′),6.79 (1H,d,J= 2.1 Hz,H-2),6.75 (1H,d,J= 8.0 Hz,H-5),6.59 (1H,dd,J= 8.0,2.1 Hz,H-6),6.42 (1H,dd,J= 8.9,2.3 Hz,H-5′),6.35 (1H,d,J= 2.3 Hz,H-3′),3.18 (2H,t,J= 7.6 Hz,H-β),2.85 (2H,t,J= 7.6 Hz,H-α);13C NMR (100 MHz,CD3COCD3)δ:133.5 (s,C-1),116.2 (d,C-2),145.5 (s,C-3),143.8 (s,C-4),116.0 (d,C-5),120.4 (d,C-6),40.1 (t,C-α),30.2 (t,C-β),204.9 (s,C-β′),113.6 (s,C-1′),165.4 (s,C-2′),103.4 (d,C-3′),165.9 (s,C-4′),108.8 (d,C-5′),133.4 (d,C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為3,4,2′,4′-四羥基二氫查爾酮。

化合物2黃色粉末(丙酮);1H NMR (400 MHz,CD3COCD3)δ:13.65 (1H,s,2′-OH),8.13 (1H,d,J= 8.9 Hz,H-6′),7.77 (1H,d,J= 15.3 Hz,H-β),7.70 (1H,d,J= 15.3 Hz,H-α),7.36 (1H,d,J= 2.1 Hz,H-2),7.23 (1H,dd,J= 8.2,2.1 Hz,H-6),6.91 (1H,d,J= 8.2 Hz,H-5),6.47 (1H,dd,J= 8.9,2.4 Hz,H-5′),6.36 (1H,d,J= 2.4 Hz,H-5′);13C NMR (100 MHz,CD3COCD3)δ:192.8 (s,-C=O),118.3 (d,C-α),145.5 (d,C-β),128.1 (s,C-1),116.0 (d,C-2),146.0 (s,C-3),149.2 (s,C-4),116.4 (d,C-5),123.5 (d,C-6),114.5 (s,C-1′),167.6 (s,C-2′),103.7 (d,C-3′),165.5 (s,C-4′),108.7 (d,C-5′),133.3 (d,C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為紫鉚花素(3,4,2′,4′-四羥基查爾酮)。

化合物3黃色針晶(丙酮);1H NMR (400 MHz,CD3COCD3)δ:7.61 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-6′),7.57 (1H,d,J= 2.1 Hz,H-2),7.34 (1H,dd,J= 8.3,2.1 Hz,H-6),6.94 (1H,d,J= 8.3 Hz,H-5),6.81 (1H,d,J= 2.0 Hz,H-3′),6.78 (1H,dd,J= 8.4,2.0 Hz,H-5′),6.64 (1H,s,H-β);13C NMR (100 MHz,CD3COCD3)δ:125.4 (s,C-1),118.6 (d,C-2),146.2 (s,C-3),148.3 (s,C-4),116.5 (d,C-5),125.7 (d,C-6),147.2 (s,C-α),112.4 (d,C-β),182.5 (s,C-β′),115.0 (s,C-1′),168.9(s,C-2′),99.4 (d,C-3′),166.6 (s,C-4′),113.5 (d,C-5′),126.5 (d,C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為3,4,2′,4′,α-五羥基查爾酮。

化合物4黃色粉末(丙酮);1H NMR (400 MHz,CD3COCD3)δ:7.47 (1H,d,J= 2.1 Hz,H-2′),7.18 (1H,dd,J= 8.3,2.1 Hz,H-6′),6.82 (1H,d,J= 8.3 Hz,H-5′),6.56 (1H,s,H-10),6.20 (1H,d,J= 1.4 Hz,H-7),6.02 (1H,d,J= 1.4 Hz,H-5);13C NMR (100 MHz,CD3COCD3)δ:147.8 (s,C-2),182.8 (s,C-3),159.9 (s,C-4),98.5 (d,C-5),169.4 (s,C-6),91.6 (d,C-7),169.5 (s,C-8),104.7 (s,C-9),112.8 (d,C-10),125.7 (s,C-1′),118.6 (d,C-2′),146.6 (s,C-3′),148.9 (s,C-4′),116.6 (d,C-5′),125.9 (d,C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為金色草素(5,7,3′,4′-四羥基噢哢)。

化合物5黃色粉末(氯仿-甲醇);1H NMR (400 MHz,C5D5N)δ:8.15 (1H,s,H-8),7.20 (1H,s,H-5),6.68 (1H,s,H-4),5.88 (1H,d,J= 9.8 Hz,H-1′),5.34 (1H,t,J= 8.8 Hz,H-4′),4.62 (1H,dd,J= 11.8,2.5 Hz,H-6′a),4.51 (3H,overlap,H-2′,3′,6′b),4.26 (1H,m,H-5′);13C NMR (100 MHz,C5D5N)δ:163.6 (s,C-1),109.1 (s,C-2),166.7 (s,C-3),94.6 (d,C-4),157.8 (s,C-4a),152.3 (s,C-4b),103.7 (d,C-5),156.3 (s,C-6),145.8 (s,C-7),109.6 (d,C-8),113.4 (s,C-8a),180.6 (s,C-9),103.1 (s,C-9a),75.8 (d,C-1′),72.4 (d,C-2′),81.1 (d,C-3′),72.9 (d,C-4′),83.4 (d,C-5′),62.3 (t,C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為芒果苷。

化合物6針狀結(jié)晶(丙酮):1H NMR (400 MHz,CD3COCD3)δ:7.14 (2H,s,H-2,6);13C NMR (100 MHz,CD3COCD3)δ:122.0 (s,C-1),110.0 (d,C-2,6),146.0 (s,C-3,5),138.6 (s,C-4),167.7 (s,-C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為沒食子酸。

化合物7無色針晶(丙酮);1H NMR (400 MHz,CD3COCD3)δ:4.72 (1H,brs,H-31a),4.68 (1H,brs,H-31b),3.21 (1H,dd,J= 10.9,5.4 Hz,H-3),1.03 (3H d,J= 2.4 Hz,H-26),1.02 (3H,overlap,H-18),1.01 (3H,overlap,H-21),0.96 (3H,s,H-30),0.94 (3H,s,H-28),0.93 (3H,overlap,H-27),0.82 (3H,s,H-29),0.57 (1H,d,J= 4.2 Hz,H-19a),0.38 (1H,d,J= 4.2 Hz,H-19b);13C NMR (100 MHz,CD3COCD3)δ:32.8 (t,C-1),31.3 (t,C-2),78.4 (d,C-3),41.2 (s,C-4),48.1 (d,C-5),21.9 (t,C-6),26.9 (t,C-7),49.0 (d,C-8),20.6 (s,C-9),27.1 (s,C-10),27.1 (t,C-11),33.7 (t,C-12),46.1 (s,C-13),49.6 (s,C-14),36.3 (t,C-15),28.8 (t,C-16),53.1 (d,C-17),18.6 (q,C-18),30.4 (t,C-19),36.8 (d,C-20),18.7 (q,C-21),35.8 (t,C-22),31.9 (t,C-23),157.3 (s,C-24),34.4 (d,C-25),22.2 (q,C-26),22.3 (q,C-27),19.8 (q,C-28),14.7 (q,C-29),26.1 (q,C-30),106.7 (t,C-31)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為24-亞甲基環(huán)阿爾廷醇。

化合物8無色針晶(丙酮);1H NMR (400 MHz,CD3COCD3)δ:5.67 (1H,s,H-4),4.29 (1H,brs,H-6),1.39 (3H,s,H-19),0.97 (3H,d,J= 6.5 Hz,H-26),0.86 (3H,s,H-29),0.84 (3H,overlap,H-21),0.83 (3H,overlap,H-27),0.78 (3H,s,H-18);13C NMR (100 MHz,CD3COCD3)δ:38.1 (t,C-1),34.7 (t,C-2),199.5 (s,C-3),126.5 (d,C-4),169.4 (s,C-5),73.2 (s,C-6),40.0 (t,C-7),30.7 (d,C-8),54.8 (d,C-9),38.8 (s,C-10),21.8 (t,C-11),40.6 (t,C-12),43.3 (s,C-13),56.8 (d,C-14),25.0 (t,C-15),29.0 (t,C-16),57.0 (d,C-17),12.3 (q,C-18),20.2 (q,C-19),37 (d,C-20),19.8 (q,C-21),34.9 (t,C-22),26.8 (t,C-23),46.8 (d,C-24),30.0 (d,C-25),19.4 (q,C-26),19.2 (q,C-27),23.8 (t,C-28),12.4 (q,C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為豆甾-4-烯-6β-羥基-3-酮。

化合物9無色針晶(丙酮);1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ:5.34 (1H,brs,H-6),3.52 (1H,m,H-3α),1.00 (3H,s,Me-19),0.92 (3H,d,J= 5.7 Hz,Me-21),0.84,0.82,0.81 (各3H,overlap,Me-26,27,29),0.67 (3H,s,Me-18);13C NMR (100 MHz,CDCl3)δ:37.4 (t,C-1),31.8 (t,C-2),71.9 (d,C-3),42.4 (t,C-4),140.9 (s,C-5),121.8 (d,C-6),32.0 (t,C-7),32.0 (d,C-8),50.2 (d,C-9),36.6 (s,C-10),21.2 (t,C-11),39.9 (t,C-12),42.4 (s,C-13),56.2 (d,C-14),24.4 (t,C-15),28.4 (t,C-16),56.9 (d,C-17),12.0 (q,C-18),19.5 (q,C-19),36.2 (d,C-20),18.9 (q,C-21),34.1 (t,C-22),26.2 (t,C-23),46.0 (d,C-24),29.3 (d,C-25),20.0 (q,C-26),19.2 (q,C-27),23.2 (t,C-28),12.1 (q,C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為β-谷甾醇。

化合物10白色粉末(氯仿-甲醇)。通過在TLC上用多種溶劑系統(tǒng)展開對(duì)比，化合物10與胡蘿卜苷的對(duì)照品斑點(diǎn)顏色及Rf值均一致，故鑒定為胡蘿卜苷。

化合物11白色粉末(石油醚-丙酮);ESI-MS:m/z293[M+Na]+。1H NMR (400 MHz,CD3COCD3)δ:3.60 (3H,s,-OCH3),2.28 (2H,t,J= 7.5 Hz,H-2),1.37～1.26 (26H,brs,13×-CH2),0.89 (3H,t,J= 6.8 Hz,H-16);13C NMR (100 MHz,CD3COCD3)δ:174.3 (s,C-1),34.8～23.8 (t,14×-CH2),14.9 (q,C-16),51.95 (q,-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]道基本一致，故鑒定該化合物為棕櫚酸甲酯。

化合物12白色粉末(石油醚-丙酮);ESI-MS :m/z353[M+Na]+。1H NMR (400 MHz,C5D5N)δ:4.75 (1H,dd,J= 11.0,4.6 Hz,H-1a),4.67 (1H dd,J= 11.0,6.4 Hz,H-1b),4.47 (1H,m,H-2),4.15 (2H d,J= 5.5 Hz,H-3),2.37 (2H,t,J= 7.5 Hz,H-2′),1.42～1.10 (26H,brs,13×-CH2),0.87 (3H,t,J= 6.7 Hz,H-16′);13C NMR (100 MHz,C5D5N)δ:67.2 (t,C-1) ,71.3 (d,C-2),64.7 (t,C-3),174.2 (s,C-1′),34.8 (t,C-2′),32.5～23.3 (t,13×-CH2),14.7 (q,C-16′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為1-棕櫚酸單甘油酯。

3.2 β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測(cè)試結(jié)果

對(duì)分離得到的部分化合物進(jìn)行β-羥高鐵血紅素形成抑制活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示化合物1～6均具有β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，其中黃酮類化合物2～4具有較好的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性，其IC50分別為：120.3±4.0、61.5±3.4、56.0±3.4 μg/mL，陽(yáng)性藥氯喹二磷酸鹽的IC50為36.5±3.6 μg/mL?；衔锘钚詼y(cè)試結(jié)果見表1、表2。

4 討論

本研究從羊角天麻根中分離鑒定了12個(gè)成分，包括6個(gè)酚酸類(1～6)、4個(gè)甾體類(7～10)、2個(gè)脂肪族類(11～12)成分。在文獻(xiàn)報(bào)道中，該植物以倍半萜、甾體及脂肪酸為主要成分，未見查爾酮與噢哢類成分報(bào)道，本研究在該植物中分離得到了3個(gè)查爾酮及1個(gè)噢哢類化合物，豐富了該植物的化學(xué)成分類型，為進(jìn)一步了解該植物的化學(xué)成分提供了依據(jù)。

β-羥高鐵血紅素形成抑制活性測(cè)試為近年來發(fā)展起來的一種體外抗瘧活性檢測(cè)方法，具有快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性藥氯喹二磷酸鹽的β-羥高鐵血紅素形成抑制率在23.8～46.6 μg/mL時(shí)呈現(xiàn)良好的量效線性關(guān)系，之后在提高濃度時(shí)因其已達(dá)到較高的抑制率，量效關(guān)系進(jìn)入非線性區(qū)，致使其抑制率隨濃度變化不明顯(表2)。本研究結(jié)果顯示，在測(cè)定的10個(gè)不同類型的化合物中，化合物1～6均具有一定的活性，其中化合物2～4具有較強(qiáng)的抑制活性，而甾體類及脂肪族類化合物均無活性。構(gòu)效分析表明：帶有酚羥基的化合物具有較好的β-羥高鐵血紅素形成抑制活性。近來有研究報(bào)道，含有多個(gè)酚羥基的黃酮類成分芹菜素具有顯著的體內(nèi)抗瘧活性，其體內(nèi)抑制伯氏瘧原蟲Plasmodiumberghei的活性在70、35、15 mg/kg/day時(shí)分別達(dá)到69.74%、50.3%、49.23%，效果十分顯著[20]。因此，羊角天麻中的黃酮類成分是否也具有較好的體內(nèi)抗瘧活性值得進(jìn)一步研究。

表1 羊角天麻中單體化合物β-羥高鐵血紅素形成抑制活性結(jié)果Table 1 β-Hematin formation inhibitory activity of compounds from D.delavayi

注：與陽(yáng)性對(duì)照組氯喹二磷酸鹽比較，*P<0.05。**CD：氯喹二磷酸鹽。

Note: Compared with the chloroquine diphosphate group,*P<0.05.**CD: chloroquine diphosphate.

表2 化合物2～4 β-羥高鐵血紅素形成抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 β-Hematin formation inhibitory activity of compounds 2-4