紅豆樹種子化學成分及其抗氧化和抑菌活性研究

翟大才，房 震，汪 勇，張明亮，胡宗浩，李 強，柏曉輝*

1 黃山學院生命與環(huán)境科學學院，黃山 245041；2 安徽省祁門縣查灣森工采育場，黃山 245600；3 黃山學院分析測試中心，黃山 245041

紅豆樹學名(OrmosiahosieiHemsl.Et Wils.)，是隸屬于紅豆樹屬(OrmosiaG．Jacks)的一種落葉喬木或半常綠喬木，也是我國II級重點保護的特有樹種[1]。紅豆樹天然分布于湖北、四川、江西、浙江、福建等省，在安徽也有零星栽培[2]。紅豆樹木材紋理美觀有光澤、耐腐蝕強而常被用于制作各種家具、地板或裝飾品；其根、皮、莖和葉都可入藥，用于治療無名腫毒、風濕關節(jié)炎等病癥[1]。

紅豆樹木材珍貴，多年來砍伐現象嚴重，導致其野生自然資源非常稀少，甚至已近枯竭；這促使人們不斷研究紅豆樹人工栽培技術，但存在紅豆樹種子產量低且大小年現象明顯，繁殖材料缺乏，發(fā)芽困難，培育幼苗難[3]等問題。

目前，對紅豆樹種子的研究主要集中在種子萌發(fā)規(guī)律[4]、不同水溫浸泡[4]和機械破皮[5]對種子萌芽率的影響、種子和幼苗性狀變異分析[6]等，而對其種子化學成分及其生物活性研究還處于空白階段。因此，本課題組以紅豆樹種子為材料，利用不同極性溶劑對其生物活性物質進行萃取，并結合氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)對其化學成分進行鑒定；同時，采用DPPH和ABTS法及抑菌圈實驗評價其生物活性物質的體外抗氧化及抑菌活性，以期為紅豆樹種子資源的開發(fā)和綜合利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 試劑與儀器

過硫酸鉀(K2S2O8)、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇等試劑均為分析純，購自于上海國藥集團；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)均為分析純，購買于東京化成工業(yè)株式會社；蛋白胨、Yeast Extract、瓊脂和維生素C(Vc)等生化試劑購買于上海生工有限公司。

SQ510C滅菌鍋(重慶雅馬拓科技公司)、ZHJH-C1106B超凈工作臺(上海智城分析儀器公司)、Agilent 7890A-5975C型氣相色譜-質譜聯用儀(美國 Agilent 公司)、UV754N紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器公司)。

1.1.2 實驗材料

本實驗中所用紅豆樹種子(憑證標本采集號-05；采集人：翟大才；鑒定人：潘健博士；采集地點：安徽歙縣；采集時間：2018年11月24日)采集于安徽歙縣坑口鄉(xiāng)。

抑菌實驗所用LB(Luria-Bertani)平板培養(yǎng)基參照文獻[7]方法配制，所用受試菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)均購買于中國典型培養(yǎng)物保藏中心并保存于本校微生物學實驗中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅豆樹種子成分的提取

稱取30.0 g新采集的紅豆樹種子置于粉碎機中完全粉碎至粉末狀，將粉末置于圓底燒瓶中并按料液比1∶16(g/mL)加入甲醇后充分混勻，60 °C恒溫萃取3 h后收集過濾后的上清液，過濾殘渣再按照上述提取步驟重復提取2次；合并3次提取液后用旋轉蒸發(fā)儀60 °C恒溫蒸發(fā)得到甲醇提取物。將甲醇提取物小心收集后稱重，然后用100 mL雙蒸水重懸甲醇提取物，混勻后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇等按體積比1∶1進行萃取，每種試劑萃取3次后合并萃取液并用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，分別收集每種試劑的萃取物并稱重；再用二甲基亞砜(DMSO)分別將上述萃取物配制成10 mg/mL后4 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 紅豆樹種子甲醇提取物GC-MS分析

選用石英毛細管柱DB-5 MS(30 m × 250 μm × 0.25 μm)為色譜柱，0.5 μL樣品以無分流方式進樣； 99.999%氦氣為載氣，流速為1.0 mL /min；柱箱程序升溫，起始溫度60 °C，以5 °C /min升至160 °C保持8 min，再以5 °C /min 升至 260 °C保持5 min，運行時間為 56 min。

離子源為電子轟擊(EI)源，電子能量為70 eV，離子源溫度設為 230 °C，四極桿溫度設為150 °C；掃描范圍設為m/z50.0～500.0，標準譜庫NIST08作為質譜數據庫。

1.2.3 紅豆樹種子萃取物對DPPH自由基的清除能力

參照文獻[8]方法并適當改善測定紅豆樹種子萃取物對DPPH自由基的清除能力，簡述如下：分別取100 μL DMSO稀釋的紅豆樹種子正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物加到0.06 mmol /L DPPH-乙醇(95%)溶液中配制成不同濃度；混勻后避光反應，并在517 nm波長處測定其吸光值(Ax)。在DPPH乙醇溶液中加入100 μL DMSO為空白對照，測其吸光值(A0)；陽性對照為Vc，每組樣品重復 3 次，以平均值按公式(1)計算清除率。

清除率(%)=[(A0-Ax)/A0]× 100%

(1)

1.2.4 紅豆樹種子萃取物對ABTS自由基的清除能力

依據文獻[9]方法測定紅豆樹種子萃取物對ABTS自由基的清除能力。取7 mmol /L ABTS與2.45 mmol /L K2S2O8溶液按體積比1∶1混勻并于暗處反應。用甲醇將上述反應液稀釋至波長734 nm處吸光值為0.68～ 0.72。分別移取不同濃度的紅豆樹種子正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物200 μL至2 mL暗處反應后的ABTS與K2S2O8混合液中，混勻反應6 min并測其吸光值(Ax)。200 μL甲醇與2 mL的ABTS與K2S2O8混合液反應后吸光值為A0。200 μL不同濃度紅豆樹種子正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物與2 mL甲醇溶液反應后吸光值為Ay。每組樣品重復 3 次，以平均值按公式(2)計算清除率。

清除率(%)=[1-(Ax+Ay) /A0]× 100%

(2)

1.2.5 紅豆樹種子萃取物的抑菌活性

參考文獻[7]方法測定紅豆樹種子萃取物的抑菌活性，測量不同受試菌抑菌圈的大小并記錄，每組樣品重復3次，求平均值來分析。

2 結果與分析

2.1 紅豆樹種子化學成分的分析

用GC-MS對紅豆樹種子的甲醇粗提取物進行分析，得到其總離子流結果(圖1)，利用峰面積歸一法對各組分的相對含量進行計算，結果見表1。從圖1離子流結果知，從紅豆樹種子粗提取物中共分離出17個色譜峰；將此17個色譜峰與標準譜庫NIST08的質譜峰進行比對共鑒定出12個化合物(表1)，占粗提取物總量的89.03%。鑒定的12個化合物中相對含量高于2.00%的依次為5-羥甲基糠醛(52.98%)、D-阿洛糖(7.24%)、2,3-二甲氧基-10,11-二氫二苯并(b,f)惡庚英-10-醇(6.51%)、甲基丁香酚(4.53%)、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮(4.45%)、黃樟素(3.75%)、α-松油醇(3.31%)、2,6-二甲氧基苯酚(2.01%)，此8種成分占總量的84.78%。

圖1 紅豆樹種子萃取物GC-MS總離子流圖Fig.1 The total ion chromatogram of the extraction of the seed of O.hosiei Hemsl.Et Wils.

2.2 紅豆樹種子萃取物的抗氧化作用

2.2.1 紅豆樹種子萃取物對DPPH自由基的清除作用

測定紅豆樹種子正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取物對DPPH自由基的清除作用，結果見圖2。從測定的結果可知，正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取物對DPPH自由基有明顯的清除作用，且萃取物濃度與清除率間呈正相關，隨著萃取物濃度的逐漸增大，DPPH清除率逐步增大。從圖2A結果可知，正丁醇萃取物濃度(X)與清除率(Y)的回歸方程為：Y=295.12X+5.854 (R2=0.978 2)，當正丁醇萃取物濃度為0.25 mg/mL時，對DPPH自由基清除率為75.17 ± 0.25%；從圖2B結果可知，乙酸乙酯萃取物濃度(X)與清除率(Y)的回歸方程為：Y=1 877.70X+10.170 (R2=0.951 5)，當乙酸乙酯萃取物濃度為0.042 mg/mL時，對DPPH自由基清除率為80.88 ± 0.04%；從圖2C結果知，石油醚萃取物濃度(X)與清除率(Y)的回歸方程為：Y=1 212.60X+1.307 (R2=0.995 6)，當石油醚萃取物濃度為0.072 mg/mL時，對DPPH自由基清除率為85.83 ± 0.07%。Vc濃度(X)與清除率(Y)的回歸方程為：Y=18 782.00X-0.553 (R2=0.992 1)。紅豆樹種子正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物及Vc對DPPH自由基清除作用的ED50值分別為0.149 6、0.021 2、0.040 2、0.002 7 mg/mL。

表1 紅豆樹種子的化學成分分析Table 1 The chemical constituents of the seed of O.hosiei Hemsl.Et Wils

圖2 紅豆樹種子不同溶劑萃取物對DPPH自由基的清除作用Fig.2 Free radical scavenging assays of different solvent extraction of the seed of O.hosiei Hemsl.Et Wils.against DPPH

2.2.2 紅豆樹種子萃取物對ABTS自由基的清除作用

測定紅豆樹種子正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取物對ABTS自由基的清除率，結果如圖3。該實驗結果可知，紅豆樹種子正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取物對ABTS自由基有顯著的清除能力，且隨著萃取物濃度的增加，其清除ABTS自由基的能力逐漸增強。從圖3A結果知，正丁醇萃取物濃度(X)與清除率(Y)的回歸方程為：Y=1 666.90X+4.701 (R2=0.987 2)，當正丁醇萃取物濃度為0.05 mg/mL時，對ABTS自由基清除率為84.80 ± 0.05%；從圖3B結果知，乙酸乙酯萃取物濃度(X)與清除率(Y)的回歸方程為：Y=323.39X+10.280 (R2=0.963 9)，當乙酸乙酯萃取物濃度為0.30 mg/mL時，對ABTS自由基清除率為98.40 ± 0.30%；從圖3C結果知，石油醚萃取物濃度(X)與清除率(Y)的回歸方程為：Y=1 605.10X+13.602 (R2=0.919 1)，當石油醚萃取物濃度為0.05 mg/mL時，對ABTS自由基清除率為90.88 ± 0.05%。Vc濃度(X)與清除率(Y)的回歸方程為：Y=21 963.00X-0.288 (R2=0.998 2)。紅豆樹種子正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物及Vc對ABTS自由基清除作用的ED50值分別為0.027 2、0.122 8、0.023 0、0.002 3 mg/mL。

圖3 紅豆樹種子不同溶劑萃取物對ABTS自由基的清除作用Fig.3 Free radical scavenging assays of different solvent extraction of the seed of O.hosiei Hemsl.Et Wils.against ABTS

2.3 紅豆樹種子萃取物的抑菌作用

檢測紅豆樹種子正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取物對金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌和綠膿桿菌等菌株的抑菌活性，結果見表2。從表2結果可知，紅豆樹種子正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取物對受試的三種革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和三種革蘭氏陰性菌大腸桿菌、綠膿桿菌、鼠傷寒沙門氏菌均具有抑制效果；其中正丁醇萃取物對大腸桿菌、綠膿桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑分別為11.17 ± 1.09、9.42 ± 0.85、9.10 ± 0.98 mm；乙酸乙酯萃取物對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑為15.18 ± 0.74 mm；石油醚萃取物對金黃色葡萄球菌和蘇云金芽孢桿菌的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑分別為10.07 ± 0.51、9.30 ± 0.15 mm。正丁醇萃取物在相同濃度下對受試菌的抑制強度為：大腸桿菌>綠膿桿菌>鼠傷寒沙門氏菌>枯草芽孢桿菌>蘇云金芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌。乙酸乙酯萃取物在相同濃度下對受試菌的抑制強度為：枯草芽孢桿菌>綠膿桿菌>大腸桿菌>鼠傷寒沙門氏菌>蘇云金芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌。石油醚萃取物在相同濃度下對受試菌的抑制強度為：金黃色葡萄球菌>蘇云金芽孢桿菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>綠膿桿菌>鼠傷寒沙門氏菌。由此結果可知，紅豆樹種子正丁醇萃取物對上述革蘭氏陰性菌的抑制效果強于革蘭氏陽性菌；而石油醚萃取物恰巧與此相反，其對上述革蘭氏陽性菌的抑制效果強于革蘭氏陰性菌。

表2 紅豆樹種子不同溶劑萃取物對不同受試菌的抑菌活性(mm)Table 2 Antibacterial activity of different solvent extraction of the seed of O.hosiei Hemsl.et Wils.against the tested bacteria (mm)

注：同行不同字母表示統(tǒng)計學上具有顯著差異(P< 0.05)。

Note:Different letters in the same row indicate statistically significant differences (P< 0.05).

3 結論

本文首次報道紅豆樹種子的化學成分，并利用GC-MS從萃取物中共鑒定出12個化合物，占萃取物總量的89.03%；其中含量最多的為5-羥甲基糠醛(52.98%)，其次為醇類(2種，9.82%)、糖類(1種，7.24%)、酚類(2種，6.53%)、酮類(1種，4.45%)和脂肪酸(2種，2.48%)；紅豆樹種子中化合物的組成及含量與本課題組前期研究的紅豆樹葉子成分[10]明顯不同，與邱亞鐵等報道的紅豆樹莖枝中化學成分也存在顯著差異[11]，各種化合物在紅豆樹內的分布值得進一步研究。從鑒定的化合物結果可知，紅豆樹種子中5-羥甲基糠醛含量最為豐富，高達52.98%；5-羥甲基糠醛不僅是一種重要的化工原料[12]，而且廣泛存在于中藥炮制品中[13]，具有抗心肌缺血和抗氧化等功效[14]。D-阿洛糖的含量次之，為7.24%；D-阿洛糖屬于一種稀有糖，是一種重要的免疫抑制劑可用于器官移植[15]，具有抑制缺血再灌注損傷[16]和抑制腫瘤細胞增殖[15]等功效，以上結果暗示紅豆樹種子具有潛在藥用開發(fā)價值。Yu Xiangyingetal.[17]報道2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮具有很強的抗氧化活性，而紅豆樹種子中也含有這類物質且相對含量排名第五為4.45%。

紅豆樹種子萃取物DPPH和ABTS自由基清除實驗結果證明，其正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取物對DPPH和ABTS自由基均具有非常強的清除能力，且抗氧化活性與萃取物濃度間呈線性相關；正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物對DPPH自由基清除率的半數有效量(ED50)依次為0.149 6 、0.021 2、0.040 2 mg/mL；對ABTS自由基清除率的半數有效量(ED50)依次為0.027 2 、0.122 8、0.023 0 mg/mL。紅豆樹種子萃取物具有較好的抗氧化活性，可能與其含有豐富的抗氧化物質如5-羥甲基糠醛、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮等相關。此外，抑菌實驗結果也表明紅豆樹種子萃取物對多種細菌均具有較好的抑制效果；其中正丁醇萃取物對大腸桿菌、綠膿桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果最佳，乙酸乙酯萃取物對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最佳，石油醚萃取物對金黃色葡萄球菌和蘇云金芽孢桿菌的抑菌效果最佳。本研究結果為紅豆樹種子資源的開發(fā)和綜合利用提供了數據支持。