離子色譜法檢測膠紅酵母R.mucilaginosa C I CC 33013胞外多糖的單糖組成

馬文錦，李梅林，王 博，張永顯，于長青，班省華

（甘肅省輕工研究院有限責任公司，甘肅蘭州 730030）

0 引言

膠紅酵母（R.mucilaginosa） 是酵母種屬的一種，研究發(fā)現(xiàn)膠紅酵母富含蝦青素、β-胡蘿卜素和β-葡聚糖，其可以將糖蜜、三乙醇胺、二乙醇胺和一些簡單的芳香族化合物作為滿足自身生產(chǎn)的氮源[1-2]。酵母菌胞外多糖（Extracellular polysaccharides，E PS）是由酵母細胞產(chǎn)生的，分布于細胞壁之外，以莢膜的形式附到細胞壁上或以黏液的形式分泌于胞外環(huán)境的同多糖或異多糖[3]，與植物多糖、動物多糖等其他來源的多糖相比，酵母胞外多糖最大的優(yōu)勢在于易于分離純化，可連續(xù)化發(fā)酵，不受地域、季節(jié)等環(huán)境的影響。因此，研究酵母胞外多糖具有較強的市場競爭力和廣闊的發(fā)展前景。

近年來，隨著糖生物學(xué)和糖化學(xué)的發(fā)展，多糖的生物活性越來越受到人們的重視，市場上出現(xiàn)了很多多糖類藥品、食品和保健品，對這些產(chǎn)品的品質(zhì)控制也就越來越重要。由于單糖是構(gòu)成多糖的基本單元，因此單糖組成分析是基礎(chǔ)性和關(guān)鍵性的研究環(huán)節(jié)。目前，關(guān)于單糖組成的測定方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法和離子色譜法。由于糖鏈沒有紫外或者熒光基團，采用高效液相色譜法時，需將樣品水解后進行柱前或柱后衍生化處理，使糖鏈帶上紫外或者熒光基團，極性發(fā)生改變，但該方法繁瑣耗時且靈敏度低[4-5]。氣相色譜法檢測單糖時，雖然靈敏度較高，但是也要對其衍生化處理，由此容易產(chǎn)生異構(gòu)體，使一種糖產(chǎn)生幾個色譜峰，對組分的分離與定量產(chǎn)生影響[6-7]。毛細管電泳法由于對常見糖類的紫外吸收較弱，也需經(jīng)過衍生后才能使得糖類達到足夠的靈敏度[8-9]。而離子色譜法最大的優(yōu)點就是樣品不需要衍生處理，就能分析幾乎所有的單糖和大部分的寡糖及低聚糖[10-12]，已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用。通過離子色譜法檢測了膠紅酵母胞外多糖的單糖組成，為常見多糖組成中單糖的定性定量分析提供了快速可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

膠紅酵母菌株，中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供；葡萄糖，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司提供；阿拉伯糖，廣州蘇喏化工有限公司提供；D-半乳糖，南京化學(xué)試劑股份有限公司提供；核糖、木糖、果糖、甘露糖，合肥博美生物科技有限責任公司提供；三氯乙酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；甲醇，海南得益化工貿(mào)易有限公司提供。

Y C3000型離子色譜儀，青島埃侖色譜科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 單糖標準溶液配制

分別配制質(zhì)量濃度均為1.00 mg/mL的阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、D-半乳糖等7種單糖的儲備液。

1.2.2 膠紅酵母胞外多糖中單糖組分的測定

試驗前期通過醇沉、脫蛋白、透析等方法得到膠紅酵母R.mucilaginosa CICC 33013菌株代謝的胞外多糖RE PS，復(fù)溶后經(jīng)D EAE-52纖維素層析和Sephadex G-100凝膠柱層析分離純化得到多糖組分RE PS2-A，高效液相凝膠滲透色譜法法測得其呈單一、對稱峰，表明得到的多糖組分RE PS2-A是均相樣品。

在已有方法[13]的基礎(chǔ)上進行改進。具體操作為:精確稱取5.00 mg多糖組分RE PS2-A溶解于濃度為2.5 mol/L的三氟乙酸中，在121℃下保存2 h，采用N2氣流對其風干。風干后的樣品用甲醇進行近一步萃取、洗滌，并用N2氣流對其風干，循環(huán)3～4次；得到的干樣品用1.00 mL的蒸餾水溶解，溶解后稀釋100倍，取25μL樣液采用離子色譜進行分析，用P A D軟件做出相應(yīng)的峰圖。設(shè)定條件如下:流動相為氫氧化鈉，流速梯度為 0～40 min，5 mmol；40～45 min，100 mmol；45～50 min，200 mmol；50.2～55.0 min，5 mmol；其中40～45 min內(nèi)同時加入100 mmol的醋酸鈉，流速設(shè)定為1 mL/min，上樣量25μL，柱溫30℃，柱型為Carbo Pac-P A10。

2 結(jié)果與分析

單糖標準圖譜見圖1。

由圖1可知，在上述試驗操作下，阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖依次出峰，并且獲得了較好的分離效果。

多糖組分RE PS2-A的單糖組成譜圖見圖2。

圖1 單糖標準圖譜

圖2 多糖組分R E PS2-A的單糖組成譜圖

由圖2可知，由出峰時間和峰面積可得，RE PS2-A由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖4種單糖組成，摩爾比為0.2∶63.1∶18.3∶18.3。其中，半乳糖的含量占到50%以上，阿拉伯糖含量最低。

3 結(jié)論

建立了一種快速、靈敏度高的適合檢測多糖中單糖組分的定性定量分析方法，為闡明膠紅酵母R.mucilaginosa CICC 33013胞外多糖的結(jié)構(gòu)組成及其活性提供技術(shù)支撐及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。此方法與傳統(tǒng)方法相比，消除了非糖類成分的干擾，提高了檢測的專屬性，結(jié)果更加真實，同時為其他類多糖的質(zhì)量控制提供了借鑒[14-15]。