高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方食品中膽堿L-肉堿含量方法研究

詹越城，何 斌，劉夢(mèng)婷，楊 娜，汪慶旗，楊 琳

（1.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江杭州 310000；2.浙江贊宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

膽堿是哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中不可或缺的一種水溶性維生素，它在生物體內(nèi)具有不可替代的基本功能。雖然人體和哺乳動(dòng)物具有合成膽堿的功能，但大量研究表明人體也需要膳食膽堿。膽堿以氯化物或酒石酸氫鹽的形式用于嬰幼兒配方食品的強(qiáng)化。當(dāng)體內(nèi)膽堿不足時(shí)，表現(xiàn)為生長(zhǎng)受阻、營(yíng)養(yǎng)不良、繁殖能力差和脂肪肝等。試驗(yàn)證明，在嬰幼兒時(shí)期攝入適量的膽堿能夠幫助提升寶寶的記憶能力。L-肉堿是一種相對(duì)分子質(zhì)量較小的類蛋白質(zhì)分子，是促進(jìn)脂類代謝的重要物質(zhì)。若體內(nèi)缺乏L-肉堿，會(huì)造成細(xì)胞能量代謝的紊亂，從而引起肌肉無(wú)力、疲勞和大量脂肪的堆積。L-肉堿對(duì)嬰兒體內(nèi)脂肪代謝至關(guān)重要，有助于嬰兒保持體溫，且有助于早產(chǎn)兒發(fā)育，被視為嬰兒必需營(yíng)養(yǎng)元素。成年人所需的膽堿、L-肉堿可由自身合成，亦可通過(guò)食物進(jìn)行補(bǔ)充。但嬰幼兒各種功能未發(fā)育完全，自身合成量非常有限，絕大部分需通過(guò)食物得到補(bǔ)充[1-3]。

目前，對(duì)于膽堿的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、離子色譜法、酶法和化學(xué)發(fā)光法等，L-肉堿的檢測(cè)方法主要有酶顯色法-分光光度法、酶-熒光法、高效液相色譜法、離子色譜法等[4-5]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)膽堿和L-肉堿的測(cè)定方法為分光光度法，該操作較為繁瑣、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)靈敏度不高。試驗(yàn)采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方食品中膽堿和L-肉堿含量，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高、重現(xiàn)性好、抗干擾性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 儀器與試劑

乙腈、甲酸均為色譜純，美國(guó)TE DIA公司提供；冰乙酸（分析純），杭州化學(xué)試劑有限公司提供；水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

膽堿，L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（含量≥99%），均購(gòu)于德國(guó)D r.Ehrenstorfer公司。

Agilent6470型液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧（ESI） 離子源，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；AR2140型電子分析天平、KS-300EI型超聲波清洗器，寧波海曙科生超聲設(shè)備公司產(chǎn)品；Centrifug-5804R型臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf產(chǎn)品；M illi-Q型純水儀，美國(guó)M illpore公司產(chǎn)品。

1.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置:將上述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各稱取0.10 g至50.00 mL容量瓶，用水溶解并定容，再用水溶液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.3 樣品制備

稱取奶粉1.00 g于100 mL容量瓶中，加入60 mL 45～50℃水溶解，振蕩混勻2 min，超聲提取30 min，待溶液溫度降低至室溫。向上述溶液中加入0.1 mL冰乙酸，用水定容至刻度，混勻。取30 mL至50 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，取上清液1.00～25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，上儀器進(jìn)行測(cè)定。

1.4 分析條件

色譜條件:色譜柱:O SAKA S OD A PC HILIC（5μm，2.0 mm×100 mm）；流速0.6 mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量2μL；流動(dòng)相A 0.1%甲酸水溶液，B乙腈；流動(dòng)相比例A/B=90/10（V/V） 質(zhì)譜條件:離子源電噴霧離子源（ESI+）噴霧壓力40 psi；干燥氣流速10 L/min，干燥氣溫度350℃，毛細(xì)管電壓4 000 V。

膽堿和左旋肉堿的質(zhì)譜優(yōu)化條件見(jiàn)表1。

表1 膽堿和左旋肉堿的質(zhì)譜優(yōu)化條件

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇ESI正離子模式，質(zhì)譜條件的優(yōu)化用直接接二通方式進(jìn)行，用0.3 mL/min的流速將質(zhì)量濃度1μg/mL膽堿和左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液注入電噴霧離子源，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析得到相應(yīng)的分子離子峰，對(duì)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（子離子）掃描，獲得二級(jí)質(zhì)譜信息，然后對(duì)裂解電壓及碰撞能進(jìn)行優(yōu)化，使分子離子和特征子離子強(qiáng)度達(dá)到最佳，然后進(jìn)一步優(yōu)化毛細(xì)管電壓、霧化器壓力、干燥器溫度和流速等質(zhì)譜參數(shù)使離子化效率達(dá)到最佳。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

膽堿和左旋肉堿都屬于大極性親水化合物，在常規(guī)C18色譜柱上很難保留，因此需要選用親水性色譜柱進(jìn)行分離。試驗(yàn)比較了HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8μm） 和P C HILIC（2.0 mm×100 mm，5μm）的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種色譜柱對(duì)膽堿和左旋肉堿保留和分離效果都不好，但是P C HILIC保留時(shí)間更加穩(wěn)定、分離效果也較好，因此選用P C HILIC色譜柱。

因采用ESI正離子模式，流動(dòng)相多使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水-乙腈，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水-甲醇，濃度5 mmol/L乙酸銨-乙腈，濃度5 mmol/L乙酸銨-甲醇。結(jié)果顯示，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物響應(yīng)和峰形都較好。

2.3 樣品提取方法的條件

嬰幼兒配方奶粉中含有很多水溶性成分和脂溶性營(yíng)養(yǎng)成分，基質(zhì)比較復(fù)雜。其中脂溶性營(yíng)養(yǎng)成分不溶于水，而膽堿和左旋肉堿水溶性良好，可用溫水直接提取。所以在用水提取后，沉淀溶于水中的蛋白質(zhì)就可以了。試驗(yàn)考查了乙腈、乙酸、三氯乙酸、亞鐵氰化鉀/乙酸鋅等沉淀劑對(duì)嬰幼兒配方奶粉中蛋白質(zhì)的沉淀效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用乙腈沉淀蛋白質(zhì)不完全，離心過(guò)濾后樣品溶液不澄清，檢測(cè)峰形較差；亞鐵氰化鉀/乙酸鋅沉淀劑沉淀效果好，但是對(duì)左旋肉堿有影響，回收率較差；三氯乙酸和乙酸沉淀蛋白質(zhì)完全，樣品溶液過(guò)濾后澄清，目標(biāo)物檢測(cè)峰形較好。從操作的便捷性和安全性考慮，試驗(yàn)采用冰乙酸作為蛋白質(zhì)沉淀劑。

試驗(yàn)比較了振蕩提取與超聲提取2種方法，結(jié)果表明，單純振蕩提取需要時(shí)間較長(zhǎng)。振蕩1 min后超聲30 min提取效率高、提取效果好。

2.4 線性關(guān)系和檢出限的考查

在試驗(yàn)所確定的色譜和質(zhì)譜條件下，對(duì)膽堿和左旋肉堿進(jìn)行測(cè)定，用水稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y），作線性方程。

標(biāo)準(zhǔn)溶液線性參數(shù)見(jiàn)表2。

2.5 方法回收率和精密度驗(yàn)證

對(duì)樣品分別進(jìn)行3個(gè)質(zhì)量濃度6次加標(biāo)回收試驗(yàn)考查回收率和精密度。

回收率試驗(yàn)（n=6） 見(jiàn)表3。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液線性參數(shù)

表3 回收率試驗(yàn)（n=6）

從表3可知，樣品中膽堿的平均回收率為80.3%～107.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～7.5%；左旋肉堿的回收率為75.4%～94.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.0%～8.2%。所以，該方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。

膽堿和左旋肉堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1，正模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（M R M） 模式下膽堿色譜圖見(jiàn)圖2，正模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（M R M） 模式下左旋肉堿色譜圖見(jiàn)圖3。

圖1 膽堿和左旋肉堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

用上述檢測(cè)方法對(duì)市售6個(gè)奶粉樣品（包括1段，2段，3段奶粉）進(jìn)行了檢測(cè)，膽堿和左旋肉堿含量實(shí)測(cè)值與產(chǎn)品標(biāo)示值進(jìn)行比較，皆符合要求。

實(shí)際樣品檢測(cè)見(jiàn)表4。

圖2 正模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下膽堿色譜圖

圖3 正模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下左旋肉堿色譜圖

3 結(jié)論

建立了H PLC-M S/M S法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方食品中膽堿和左旋肉堿的檢測(cè)方法。優(yōu)化了前處理提取、凈化、色譜和質(zhì)譜條件，使其目標(biāo)物與干擾物有良好的分離。該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，可用于實(shí)際檢測(cè)工作。

表4 實(shí)際樣品檢測(cè)/mg·（100 g）-1