五禽戲?qū)χ心昴行源x綜合征患者腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的干預(yù)研究

孫紅梅，鐘亞平

代謝綜合征發(fā)病率和死亡率呈逐年增高且明顯年輕化趨勢，深入研究MS發(fā)病原因和機制、尋找科學合理干預(yù)方式已成為亟待解決的健康問題。以腸道菌群結(jié)構(gòu)變化為切入點探討慢性代謝性疾病已成為國際上的研究熱點[1]。健康腸道菌群具有減重、降壓、改善糖脂代謝、抗炎、抗氧化等功效，適宜運動可優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善宿主腸道微生態(tài)。新編健身氣功五禽戲可有效干預(yù)中年男性MS，但五禽戲干預(yù)MS的生物學機制尚需完善，僅從五禽戲練習引起機體自身生理功能改善解釋五禽戲干預(yù)MS有效性并不充分[2]。基于此，文章對五禽戲干預(yù)中年男性MS患者和中年男性健康人腸道菌群及其代謝產(chǎn)物進行研究，觀察中年男性MS患者與普通中年男性健康人腸道菌群差異及五禽戲?qū)χ心昴行訫S患者和中年男性健康人腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的干預(yù)效果，分析腸道菌群及其代謝產(chǎn)物與MS核心病變指標間關(guān)系，尋找與中年男性MS發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵菌群，探討五禽戲干預(yù)中年男性MS有效性的微生物學機制，為臨床預(yù)防、治療、緩解甚至改善MS提供新的干預(yù)靶點。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

MS患者選取標準：參照中華醫(yī)學會糖尿病分會2004年的診斷標準，具備以下各項中3項或全部者[3]：(l)超重和(或)肥胖：BMI≥25 kg/m2；(2)高血壓：血壓≥140/90 mmHg，和(或)已確診為高血壓并治療者；(3)高血糖：空腹血糖≥6.l mmol/L，和(或)餐后2 h小時血糖≥7.8 mmol/L，和(或)已確診為糖尿病并治療者；(4)血脂異常：空腹血TG≥l.7 mmol/L，及(或)空腹血 HDL-C＜0.9 mmol/L(男)。根據(jù)此MS診斷標準在山東省日照市東港區(qū)選取30名男性 MS患者，隨機分為 MS對照組(MSCG，15人)和MS五禽戲組(MSWQXG，15人)；同時選取30名健康男性作為健康對照組(HCG，15人)和健康五禽戲組(HWQXG，15人)。所有受試者經(jīng)病史詢問和體檢篩選無自身免疫疾病、嚴重精神疾病、腫瘤、內(nèi)分泌異常等疾病，且運動風險評估后可進行中等強度(60% ～70%最大心率)運動；經(jīng)相關(guān)飲食和體力活動問卷[2，4]調(diào)查，日常飲食和體力活動無顯著差異，飲食均以小麥和稻米等谷類、蔬菜和少量肉食為主；近1月內(nèi)未服用抗生素、甾體類藥物、胃腸動力類藥物、微生態(tài)制劑、酸奶及其它影響腸道菌群的制劑等，近4周內(nèi)無腹瀉、痢疾等胃腸道疾病史且既往無胃腸道手術(shù)史。

本研究的全過程經(jīng)山東體育學院倫理委員會批準，接受其監(jiān)督，并獲得所有受試者自愿簽署的實驗知情同意書。

表1 受試者基本情況(X±s)Table 1 List of subjects'basic information

各組受試者基本情況如表1所示。與HCG、HWQXG受試者相比，MSCG、MSWQXG受試者收縮壓、舒張壓和體重指數(shù)均顯著升高(P＜0.05)；HCG和HWQXG受試者各指標間、MSCG和MSWQXG受試者各指標間均無顯著差異。

1.2 研究方法

1.2.1 運動方案 HCG和MSCG受試者保持原有生活規(guī)律不變；HWQXG和MSWQXG受試者在教練指導下進行新編健身氣功五禽戲練習。HWQXG和MSWQXG受試者每天早上07∶00～08∶00跟隨伴奏樂練習五禽戲3遍，約40～50 min，準備活動和整理活動各5～10 min，合計約1 h，每天1次，每周6天，共6個月。五禽戲練習強度標準為：通過心率控制運動強度，用芬蘭產(chǎn)Polar Rs800心率遙測儀監(jiān)控運動中心率。靶心率=(年齡預(yù)計最大心率-安靜心率)×50% ～70%+安靜心率，前3周運動強度逐漸遞增，但運動靶心率不超過最大心率的65%，第3周后運動強度逐漸穩(wěn)定，運動靶心率可達最大心率的70%[3]。實驗運動方案中五禽戲的具體練習時間為2017年5月至10月。實驗期間要求受試者保持生活方式、飲食習慣不變，避免不良精神刺激，不服用微生態(tài)制劑及酸奶等，不習練其它任何健身項目和中等強度以上運動項目，以盡可能排除五禽戲練習外的其它因素對腸道菌群的干擾。

1.2.2 糞便和血液樣本取材 HCG、MSCG、HWQXG和MSWQXG受試者在實驗開始的前一天清晨和2個月、4個月、6個月五禽戲干預(yù)結(jié)束后次日清晨空腹留取新鮮糞便各1次，并抽取靜脈血各5 ml。糞便樣本用無菌棉簽挑取約5.0 g放于無菌干燥采便盒內(nèi)，置于厭氧罐備測。血液樣本室溫下靜置30 min，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min后取血清，-70℃冰箱保存?zhèn)錅y。

1.2.3 糞便和血液指標測試 糞便指標測試：(1)腸道菌群測定：參照孫紅梅[5]和傅朝暉等[6]的無菌培養(yǎng)計數(shù)法，對糞便可培養(yǎng)菌群進行稀釋、培養(yǎng)、鑒定、計數(shù)。培養(yǎng)菌群包括：雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、梭菌、大腸埃希菌、梭桿菌、腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌、韋榮球菌。培養(yǎng)基由深圳市寶安康生物技術(shù)有限公司提供。(2)短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFAs)測定：包括乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和正丁酸(n-butyric acid，BA)，用氣相色譜法檢測。試劑盒由上海必優(yōu)生物科技有限公司提供。

血液指標測試：空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)采用葡萄糖氧化酶法；空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、胰高血糖素樣肽 -1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)和胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like peptide-2，GLP-2)均采用酶聯(lián)免疫吸附法；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)采用鱟試劑基質(zhì)偶氮顯色法。胰島素抵抗狀態(tài)評價公式為：胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index，HOMA-IR)=FBG×FINS/22.5[2]。試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供。

上述測試均由山東體育學院日照校區(qū)實驗中心和山東省日照市婦幼保健院檢驗科協(xié)助完成，所有操作均按試劑說明書要求進行。

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，各指標結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，顯著性水平取P＜0.05和P＜0.01。組內(nèi)和組間各指標比較采用單因素方差分析，各指標間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)法。

2 研究結(jié)果

2.1 HCG、HWQXG、MSCG和 MSWQXG受試者相關(guān)指標測試結(jié)果

圖1 HCG受試者腸道菌群與HOMA-IR指標變化趨勢Graph 1 Changing trend chart about intestinal flora and HOMA-IR of HCG subjects

圖2 HCG受試者腸道菌群代謝產(chǎn)物與HOMA-IR指標變化趨勢Graph 2 Changing trend chart about intestinal flora's metabolites and HOMA-IR of HCG subjects

圖3 HWQXG受試者腸道菌群與HOMA-IR指標變化趨勢Graph 3 Changing trend chart about intestinal flora and HOMA-IR of HWQXG subjects

圖5 MSCG受試者腸道菌群與HOMA-IR指標變化趨勢Graph 5 Changing trend chart about intestinal flora and HOMA-IR of MSCG subjects

圖6 MSCG受試者腸道菌群代謝產(chǎn)物與HOMA-IR指標變化趨勢Graph 6 Changing trend chart about intestinal flora's metabolites and HOMA-IR of MSCG subjects

圖7 MSWQXG受試者腸道菌群與HOMA-IR指標變化趨勢Graph 7 Changing trend chart about intestinal flora and HOMA-IR of MSWQXG subjects

圖8 MSWQXG受試者腸道菌群代謝產(chǎn)物與HOMA-IR指標變化趨勢Graph 8 Changing trend chart about intestinal flora's metabolites and HOMA-IR of MSWQXG subjects

五禽戲干預(yù)前，與HCG、HWQXG受試者相比，MSCG、MSWQXG受試者腸道雙歧桿菌(P＜0.05)、乳酸桿菌(P＜0.05)、擬桿菌、梭菌、雙歧桿菌/大腸埃希菌(P ＜0.05)、AA、PA、BA(P ＜0.05)、GLP-1(P＜0.05)、GLP-2(P ＜0.05)均降低，大腸埃希菌(P＜0.05)、梭桿菌、腸球菌、葡萄球菌、韋榮球菌、LPS(P ＜0.01)、FBG(P ＜0.05)、FINS(P ＜0.01)、HOMA-IR(P＜0.05)均增加。

五禽戲干預(yù)期間，組內(nèi)不同時相比，HWQXG、MSWQXG受試者隨練習時間延長各指標均出現(xiàn)不同程度改變，雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、梭菌、雙歧桿菌/大腸埃希菌、AA、PA、BA、GLP-1、GLP-2增加，大腸埃希菌、梭桿菌、腸球菌、葡萄球菌、韋榮球菌、LPS、FBG、FINS、HOMA-IR 降低；HCG 和HWQXG、MSCG和 MSWQXG組間同時相比，HWQXG和MSWQXG受試者各指標也出現(xiàn)與組內(nèi)不同時相比相同的變化趨勢。組內(nèi)不同時相與HCG和HWQXG、MSCG和MSWQXG組間同時相比較各指標變化趨勢具體見圖1至圖8。

2.2 MSCG和MSWQXG受試者腸道菌群相關(guān)指標與胰島素抵抗指標相關(guān)性測試結(jié)果

表2 MSCG和MSWQXG受試者相關(guān)指標測試結(jié)果Table 2 List of testing results of MSCG and MSWQXG subjects

由表2可知，五禽戲干預(yù)結(jié)束后，與MSCG相比，MSWQXG受試者雙歧桿菌(P＜0.01)、乳酸桿菌(P＜0.05)、擬桿菌、梭菌(P＜0.05)、雙歧桿菌/大腸埃希菌(P＜0.01)、AA(P＜0.05)、PA(P＜0.05)、BA(P ＜0.05)、GLP-1(P ＜0.01)、GLP-2(P＜0.01)增加，大腸埃希菌(P＜0.05)、葡萄球菌(P ＜0.05)、LPS(P ＜0.01)、FBG(P ＜0.05)、FINS(P＜0.01)、HOMA-IR(P＜0.01)降低。

表3 MSCG和MSWQXG受試者腸道菌群相關(guān)指標與HOMA-IR相關(guān)性(r：相關(guān)系數(shù))Table 3 List of correlation between intestinal flora and HOMA-IR of MSCG and MSWQXG subjects

MSCG和MSWQXG受試者雙歧桿菌(P＜0.05)、乳酸桿菌(P＜0.05)、擬桿菌、梭菌、雙歧桿菌/大腸埃希菌(P ＜0.05)、AA、PA、BA(P ＜0.05)均與 HOMA-IR呈負相關(guān)，大腸埃希菌(P＜0.05)、梭桿菌、腸球菌、葡萄球菌(P＜0.05)、韋榮球菌、LPS(P＜0.05)均與HOMA-IR呈正相關(guān)，MSCG受試者各指標與HOMA-IR的相關(guān)系數(shù)和MSWQXG受試者各指標與HOMA-IR的相關(guān)系數(shù)間差異不具有顯著性。

3 分析討論

3.1 中年男性MS患者與中年男性健康人腸道菌群差異分析

物種個體多樣性使其在基因水平形成相對穩(wěn)定的“核心微生物組”，物種個體不同生理狀態(tài)，如肥胖、高血壓、糖尿病等，與物種核心微生物組和物種個體微生物組間的偏差密切相關(guān)[1，7]。漫長的“協(xié)同進化”過程中腸道菌群與宿主間形成穩(wěn)定微生態(tài)平衡，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物與宿主間進行廣泛互惠交流，參與宿主健康穩(wěn)態(tài)維持[8]。腸道微生態(tài)一旦失衡，會導致宿主腸道菌群多樣性、穩(wěn)定性、豐度、定植抗性和生物學功能等改變，誘發(fā)各種慢性代謝性疾病。對肥胖者和瘦者腸道菌群基因數(shù)量進行腸道元基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，低菌群基因組高體脂率、血脂異常、糖代謝紊亂、胰島素抵抗、炎癥表型更為顯著，低腸道菌群基因數(shù)量導致肥胖者代謝異常，且深入研究發(fā)現(xiàn)，在門分類水平上，低菌群基因組以擬桿菌門、變形菌門居多，高菌群基因組以放線菌門、微疣菌門和古生菌居多；在屬分類水平上，低菌群基因組以阿克曼菌屬、梭菌屬居多，高菌群基因組以產(chǎn)丙酸鹽菌群居多[9]。腸道宏基因組兩階段關(guān)聯(lián)分析鑒定出約6萬個2型糖尿病相關(guān)分子標記，從分子水平明確糖尿病與非糖尿病患者腸道菌群存在差異，糖尿病患者腸道微生態(tài)失衡，梭菌等產(chǎn)丁酸菌明顯減少，機會致病菌明顯增加[10]。新疆哈薩克族高血壓患者擬桿菌屬和梭菌屬出現(xiàn)顯著異常，梭菌屬16SrDNAV3區(qū)的變性梯度凝膠電泳圖譜出現(xiàn)1條Unculturedbacterium clonenbw1009b01c1優(yōu)勢帶[11]。本研究中，與中年男性健康人各指標差異顯著性統(tǒng)計分析顯示，中年男性MS患者糞便雙歧桿菌、乳酸桿菌及雙歧桿菌/大腸埃希菌顯著降低，大腸埃希菌、葡萄球菌顯著增加，且反映MS核心病變胰島素抵抗的指標HOMA-IR與雙歧桿菌、乳酸桿菌及雙歧桿菌/大腸埃希菌呈顯著負相關(guān)，與大腸埃希菌、葡萄球菌呈顯著正相關(guān)，此外，擬桿菌、梭菌、梭桿菌、腸球菌、韋榮球菌也有不同程度變化及與HOMA-IR的不同程度相關(guān)性，提示中年男性MS發(fā)生發(fā)展與腸道菌群變化，尤其是雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌、葡萄球菌的變化密切相關(guān)。SCFAs、LPS是腸道菌群的重要代謝產(chǎn)物，中年男性MS患者糞便AA、PA、BA顯著降低，LPS顯著升高，提示患者腸道菌群出現(xiàn)紊亂，產(chǎn)SCFAs菌群減少，產(chǎn)LPS革蘭氏陰性菌增多。

3.2 五禽戲干預(yù)中年男性MS患者腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的分析

3.2.1 五禽戲干預(yù)中年男性MS患者腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的效果分析 目前運動對健康人群腸道菌群影響的研究處于起步階段，運動對MS人群腸道菌群影響的研究尚未見到。愛爾蘭橄欖球運動員腸道菌群多樣性在門、綱、屬、科等分類水平均有顯著增加，厚壁菌門、阿克曼菌、瘤胃球菌、琥珀酸弧菌科菌群數(shù)量增多，擬桿菌門、乳酸桿菌科菌群數(shù)量顯著減少[12]。研究分析1 493例“美國胃腸道工程”志愿者糞便樣本發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常運動人群具有更高的腸道菌群多樣性，厚壁菌門豐度顯著增加[13]。腸道菌群多樣性增加對于健康穩(wěn)定的腸道微生態(tài)環(huán)境維持至關(guān)重要，運動可對腸道菌群結(jié)構(gòu)進行積極性調(diào)整。最新研究顯示[13]，良好運動習慣能顯著增加腸道中有益菌豐度，降低有害菌豐度，其中有益菌擬桿菌科、青春雙歧桿菌、丁酸鹽產(chǎn)生菌等顯著增加，SC-FAs產(chǎn)生增多。此外，國內(nèi)有關(guān)傳統(tǒng)體育項目的研究也證實[5，14]，八段錦、太極拳可顯著改善老年人群腸道菌群多樣性和穩(wěn)定性，塑造促進健康的腸道微生態(tài)。文章首次從屬水平上研究運動干預(yù)中年男性MS患者和中年男性健康人腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的效果，結(jié)果提示五禽戲干預(yù)可優(yōu)化宿主腸道微生態(tài)，并呈現(xiàn)明顯的時間劑量效應(yīng)：雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、梭菌、雙歧桿菌/大腸埃希菌、SCFAs及GLP-1、GLP-2隨五禽戲干預(yù)時間延長逐漸上升，大腸埃希菌、梭桿菌、腸球菌、葡萄球菌、韋榮球菌、LPS隨五禽戲干預(yù)時間延長逐漸下降。

3.2.2 五禽戲干預(yù)中年男性MS的微生物學機制分析 前期研究已經(jīng)證實[2]，五禽戲干預(yù)可顯著改善中年男性MS患者肥胖、高血壓、血脂異常、高血糖、胰島素抵抗等各危險組分。基于腸道菌群與慢性代謝性疾病的密切關(guān)系及本研究結(jié)果推測，五禽戲干預(yù)優(yōu)化中年男性MS患者腸道菌群及其代謝產(chǎn)物可能是五禽戲促進中年男性MS改善的重要微生物學機制。

MS與肌肉、肝臟和脂肪組織中多種炎性因子白細胞介素-1、白細胞介素-6、C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子-α和炎性趨化因子單核細胞趨化蛋白-1、巨噬細胞炎性蛋白-1a等表達增加有關(guān)。革蘭氏陰性菌細胞壁成分LPS可啟動固有免疫系統(tǒng)激活低度慢性炎癥反應(yīng)[15]。MS患者腸道菌群失調(diào)，雙歧桿菌、乳酸桿菌等減少，革蘭氏陰性菌大腸埃希菌等增加，腸道定植抗力雙歧桿菌/大腸埃希菌降低，致病菌和外籍菌定植能力增強，腸道黏膜屏障損傷，形成“腸漏”，LPS入血驟增。雙歧桿菌和乳酸桿菌可增強與腸道上皮細胞增殖分化、腸黏膜屏障功能等密切相關(guān)的細胞骨架維護和緊密連接蛋白Occludin、ZO-1及閉合蛋白等的表達，修復(fù)受損腸道黏膜，減輕炎癥反應(yīng)[16-17]。五禽戲干預(yù)2個月時，中年男性MS患者腸道微生態(tài)即出現(xiàn)良性逆轉(zhuǎn)，血LPS、FBG、FINS降低，HOMA-IR減小，并呈現(xiàn)明顯五禽戲練習時間依賴性，提示長期五禽戲干預(yù)可通過改善宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)，降低腸道黏膜通透性，減少LPS入血，減輕MS炎癥反應(yīng)，降低胰島素抵抗。

SCFAs與腸黏膜內(nèi)分泌L細胞上G蛋白偶聯(lián)受體41和43結(jié)合可刺激L細胞分泌GLP-1、GLP-2[18]。GLP-1可減緩胃腸蠕動，抑制胃排空，降低食欲，促進胰島β細胞再生和修復(fù)；GLP-2能增強腸道隱窩細胞增殖和腸絨毛生長率，抑制腸黏膜上皮細胞凋亡，促進其增生，改善腸道黏膜屏障[19]。益生元可改變肥胖小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加血液GLP-1；藥物致GLP-1缺失，益生元補充在體脂率、糖代謝和炎癥反應(yīng)激活等方面的良性作用被抑制[20]。益生元配合含糖飲食可增加腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌，保護腸道緊密連接完整性，降低LPS、炎癥因子等，給予GLP-2拮抗劑/興奮劑處理上述作用消失/重現(xiàn)[20]。五禽戲干預(yù)增加中年男性MS患者腸道梭菌、擬桿菌、雙歧桿菌等SCFAs產(chǎn)生菌數(shù)量，血液 SCFAs、GLP-1、GLP-2 增多，可促進新生腸上皮細胞遷移，加速腸上皮黏膜修復(fù)，減輕炎癥反應(yīng)，保護胰島β細胞，促進其再生。

此外，微生物學研究證實，乳酸菌和雙歧桿菌等可通過菌體膽鹽水解酶脫結(jié)合膽鹽共沉淀膽固醇、菌體細胞壁直接吸收膽固醇、菌體膽固醇氧化酶降解膽固醇等途徑改善宿主血脂代謝[21-22]；乳酸桿菌可通過增加禁食脂肪誘導因子Angiopoietin-like 4蛋白表達抑制脂蛋白脂肪酶，調(diào)節(jié)宿主脂肪存儲[1]；乳酸菌可通過胞外蛋白酶和羧肽酶等水解乳蛋白釋放阿片活性肽和高活性酪蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶等降壓物質(zhì)、菌體細胞壁肽聚糖等直接降壓、促進腸道吸收調(diào)節(jié)血壓的礦物質(zhì)等途徑改善宿主血壓[23-24]。基于此，推測五禽戲還可通過干預(yù)宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)直接改善血脂代謝、脂肪存儲和高血壓等途徑有效改善中年男性MS，后續(xù)研究中將繼續(xù)進行深入探討。

4 結(jié)論

中年男性MS患者腸道菌群失調(diào)，五禽戲干預(yù)優(yōu)化中年男性MS患者腸道菌群及其代謝產(chǎn)物脂多糖、短鏈脂肪酸、胰高血糖素樣肽-1、胰高血糖素樣肽-2可能是五禽戲促進中年男性MS改善的重要微生物學機制。