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    茄褐紋病菌的分離鑒定及培養(yǎng)基篩選

    2019-06-24 02:32:37馬珂
    安徽農學通報 2019年10期
    關鍵詞:分離鑒定篩選培養(yǎng)基

    馬珂

    摘 ?要:對茄褐紋病菌的形態(tài)及適宜培養(yǎng)基類型進行了分析,在茄子的不同發(fā)病部位分離出α型、β型2種分生孢子;實驗結果顯示,燕麥培養(yǎng)基是最適宜褐紋病菌產孢的培養(yǎng)基,其次為PSA。

    關鍵詞:茄褐紋病菌;分離鑒定;培養(yǎng)基;篩選

    中圖分類號 S436.411文獻標識碼 A文章編號 1007-7731(2019)10-0074-03

    褐紋病(Phomopsis vexans)是茄子重要的病害之一,主要危害茄子果實,影響果實的商品性。一般造成果腐發(fā)生率在20%~30%[1],嚴重的高達80%[2,3],茄子采種田因褐紋病的大發(fā)生而導致種子嚴重減產,甚至絕收。

    茄褐紋病菌屬半知菌亞門球殼孢目擬莖點霉屬,病斑上產生的黑色分生孢子器初埋生于寄主表皮下,成熟后突破表皮而外露;孢子器單獨地生子座上,呈凸透鏡形,具有孔口,在自然狀態(tài)下,Phomopsis的分生孢子器多數(shù)僅含有α-型孢而無β-型孢,年佳續(xù)[4]綜合論述了擬莖點霉屬的檢測技術,認為形態(tài)學鑒定的傳統(tǒng)方法仍是主要鑒定方法之一。羅利娟[5]對8種擬莖點霉在不同培養(yǎng)條件下的產孢情況進行了研究,以其解決自然條件下擬莖點霉屬的鑒定問題。陳永青、姜子德[6,7]分別用分子生物學的方法對多種擬莖點霉屬真菌進行了系統(tǒng)研究,結果表明,Phoma與Phomopsis兩屬之間缺乏明顯的區(qū)分界限,在Phomopsis的分類地位上仍存在著界限模糊的問題。周永力[8]對Phomopsis的個體發(fā)育做了較為具體的闡述,主要涉及人工培養(yǎng)條件下的Phomopsis的產孢形式、孢子形態(tài)及菌落的生長特點等方面。油球是Phomopsis屬的一個穩(wěn)定的特征,可作為該屬的判斷依據(jù)。溫度成為影響孢子類型產生不同的主要因素,傳統(tǒng)觀點認為,不同類型的孢子形態(tài)的產生是與所發(fā)病的植株部位有關,在自然狀態(tài)下,Phomopsis的分生孢子器大多僅含有α-型孢而無β-型孢。本研究通過對采集樣本的徒手切片、鏡檢,以及篩選適宜培養(yǎng)基等方法,在較短時間內用較為經(jīng)濟的手段,對茄褐紋病菌進行準確的初判,并對茄褐紋病菌的產孢條件進行了進一步研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試菌株 HA、HB采自安徽合肥,HY采自安徽和縣。

    1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基。

    1.2 儀器及試劑 光學顯微鏡,顯微攝像顯微鏡 (OLYMPUS),解剖刀,鑷子,剪刀,培養(yǎng)皿,載玻片,蓋玻片,恒溫箱。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 病原菌分離純化 采用PDA培養(yǎng)基進行常規(guī)組織分離法,于25℃培養(yǎng)純化,記錄菌落的形態(tài)和顏色,同時對病組織進行徒手切片、鏡檢,觀測病原菌形態(tài)。并按柯赫氏法則[9]加以確認,獲得茄褐紋病菌菌株3株,分別編號HA、HB、HY。

    1.3.2 培養(yǎng)基篩選

    1.3.2.1 實驗培養(yǎng)基的制備 (1)PSA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,水1000mL;(2)PSA+VB1培養(yǎng)基:在原有PDA培養(yǎng)基成分中添加5mg維生素B1;(3)燕麥培養(yǎng)基:燕麥片30g,瓊脂20g,水1000mL;(4)胡蘿卜培養(yǎng)基:200g胡蘿卜榨汁,25g瓊脂,水1000mL;(5)大豆培養(yǎng)基:干豆140g浸泡數(shù)小時后磨漿榨汁,瓊脂4g,水1000mL;(6)玉米培養(yǎng)基:玉米粉300g,瓊脂17g,水1000mL;(7)蛋白胨培養(yǎng)基:蛋白胨5g,蔗糖10g瓊脂14g,水1000mL;(8)查彼培養(yǎng)基:蔗糖30g,硝酸鈉2g,氯化鉀0.5g,硫酸亞鐵0.01g,磷酸氫二鉀1g,硫酸鎂0.5g,瓊脂17g,水1000mL;(9)茄汁培養(yǎng)基:茄子200g榨汁,瓊脂25g,水1000mL。

    1.3.2.2 菌絲生長速率的測定 將茄褐紋病菌菌株HA、HB、HY分別在PDA斜面上活化3d,然后轉移至PSA平板上培養(yǎng)5d。在培養(yǎng)好的菌落平板上沿菌絲生長邊緣用打孔器打直徑為6mm的小菌碟,分別移置不同培養(yǎng)基平板的中央,3次重復。25℃條件下恒溫培養(yǎng),3d后按十字交叉法測量菌落的直徑,取平均值,測定生長速率。

    2 結果與分析

    2.1 茄褐紋病病原的鑒定 茄褐紋病菌存在2種分生孢子:α型及β型分生孢子。α-型孢子為單孢,無色、長圓柱形、球形、梭形,1端或2端較尖,有1~2個大油球或兩端各聚集多個小油球。β型呈細長線狀,并在一端彎曲成鉤,兩者均為無色單胞。經(jīng)鏡檢得知,寄主發(fā)病部位不同,其分生孢子類型有明顯差異:果實上分離的分生孢子有2種類型,其中多數(shù)為α型分生孢子,伴有少量的β型分生孢子;從莖稈上的病斑采集到的都是β型分生孢子;葉片上的均為α型分生孢子。各部位分生孢子形態(tài)見圖1,分生孢子器形態(tài)見圖2。

    2.2 培養(yǎng)基的篩選 3個褐紋病菌菌株在9種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀及產孢情況結果見表1,菌株生長情況結果見圖3。由表1可知,能夠產孢的培養(yǎng)基有PSA、燕麥、玉米、胡蘿卜,其產孢量依次為燕麥>PSA≥玉米>胡蘿卜,產孢時間除胡蘿卜培養(yǎng)基的時間在15d以上外,其他3種培養(yǎng)基的產孢時間都在10d以上。由圖3可知,菌絲生長較好的培養(yǎng)基種類有PSA、茄汁、玉米,不適合菌絲生長培養(yǎng)基為查彼和蛋白胨。3個菌株在不同的培養(yǎng)基上的菌絲生長情況存在差異,HA菌絲生長最適的培養(yǎng)基為茄汁培養(yǎng)基,HB最適的為玉米培養(yǎng)基,HY最適的為PSA培養(yǎng)基。HB在9種培養(yǎng)基上的菌絲生長情況總體上優(yōu)于HY、HA,HA的菌絲生長為最低,在產孢情況上,3個菌株的表現(xiàn)較為一致。

    3 討論

    茄褐紋病菌2種類型的分生孢子(β型和α型)2端的油球,已經(jīng)成為Phpmopsis的分類標志。筆者在實驗中觀察到,α型分生孢子的油球多數(shù)情況下保持在2個(1端1個),在極少數(shù)情況下,可以觀察到有3個油球存在。這一特征不僅是自然條件下形成的分生孢子,而且是人工條件下形成的分生孢子所共有的。而對于β型分生孢子,除在自然條件下較少見到外,因其不具有生殖能力,所以在一般人工培養(yǎng)條件下無β型分生孢子出現(xiàn)。目前,國內對茄褐紋病菌的分類研究仍較少,因實驗采集的菌株較少,研究存在著很大的局限性,有待于進一步深入。

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