不同處理方式對槐米中蘆丁穩(wěn)定性的影響

劉修樹, 付恩桃， 方麗波, 范高福, 何曉麗

(合肥職業(yè)技術學院 生物工程學院,安徽 合肥 238000)

蘆丁，又名蕓香苷、維生素P、路通等，存在于槐、連翹、棗和蒲公英等多種藥用植物中[1-2]，現代藥理研究顯示蘆丁有降低毛細血管通透性、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降脂等多種藥理活性[3-4]，在醫(yī)藥、保健品、化妝品等方面有著廣泛的應用[5-6]。但蘆丁在化學結構上屬于黃酮苷類，含有苷鍵和酚羥基[7-8]，容易受到植物中自身存在的酶、光[9]及空氣中水分、氧氣的影響而產生變質分解，失去原來的活性，含量降低，因此含有活性成分蘆丁的中藥材貯存方法的選擇是保證其質量的一個非常重要的途徑，目前國內對于這方面研究報道文獻較少。本文針對上述影響蘆丁穩(wěn)定的因素，選擇蘆丁含量高、來源廣的中藥材槐米作為研究對象?；泵资莵碓从诙箍浦参锘盨ophorajaponicaL.的干燥花蕾，具有涼血止血，清肝瀉火之功效[10]，蘆丁是其主要活性成分，2015版《中國藥典》規(guī)定了槐米的貯藏條件：置于干燥處，防潮，并限定其含水量不得過11.0%，蘆丁的含量不得少于15.0%。藥典規(guī)定貯藏條件主要控制水分，而對其他因素沒有明確的要求，因此對槐米的貯存方式的考察具有非常重要的實際意義。通過對新鮮槐米采用不同的方式處理后留存，達到殺滅酶的活性，避免光、空氣等因素的影響來考察槐米中蘆丁穩(wěn)定性，從而優(yōu)化槐米最佳的貯存方法，為臨床合理使用槐米藥材提供理論依據，同時也為類似性質中藥貯存提供方法學借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗材料 新鮮槐米2014年購自于安徽普仁中藥飲片有限公司。蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，含量測定用，批號110726-200409)。

1.1.2 儀器設備 高效液相色譜儀：Agilent 1200高效液相色譜儀(包括：Agilent G1310A四元泵，Agilent G1322A 真空在線脫氣機，Agilent G1314B-VWD紫外檢測器，Agilent1200化學工作站);DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒)；P20000真空包裝機(廣州保士美)；電子天平(瑞士梅特勒)；BCD-301WBD電冰箱(合肥美菱)。

1.1.3 試劑 含量測定用甲醇為色譜純(上海國藥集團)，提取用甲醇為分析純(天津光復精細化工有限公司)，變色硅膠(青島裕寶精細化工有限公司)，水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 藥材處理方法 一般貯存方法 新鮮的槐米藥材置搪瓷托盤中，干燥箱60 ℃烘干，分10 g包裝，在室溫、干燥、避光的地方保存。

1.2.1.1 真空貯存方法 新鮮槐米藥材置搪瓷托盤中，干燥箱60 ℃烘干，分10 g真空包裝，兩種方式貯存：一是在室溫干燥地方，另一是在冰箱冷藏保存(置變色硅膠干燥劑)。

1.2.1.2 乙醇殺酶貯存方法 新鮮槐米藥材置搪瓷托盤中，噴乙醇拌勻，燜潤30 min，干燥箱60 ℃烘干，分10 g包裝，冰箱冷藏保存(置變色硅膠干燥劑)。

1.2.1.3 蒸氣殺酶貯存方法 蒸鍋盤子上鋪一層紗布，新鮮槐米均勻鋪在紗布上，蒸氣蒸3 min，干燥箱60 ℃烘干，分10 g包裝，冰箱冷藏保存(置變色硅膠干燥劑)。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-1%冰醋酸(45∶55)；流速為1 mL/min；t=30 ℃；檢測波長257 nm。理論板數按蘆丁峰計算應不低于2 000。在此條件下樣品中蘆丁與其他相關峰均能良好的分離[11]。

1.2.3 待測樣品溶液的制備 取槐米粗粉約0.1 g，精密稱定，置具塞的錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率25 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，過濾。精密量取濾液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。

圖1 蘆丁對照品色譜圖

圖2 槐米藥材色譜圖

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

精密稱取105 ℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品10.28 g，加流動相制成蘆丁標準貯備液(1.208 mg/mL)。再分別配成5.14、10.28、20.56、25.70、51.40、102.8 μg/mL的系列對照品溶液，分別吸取上述溶液20 μL，進樣量為5 μL，經測定，分別得到對照品的峰面積為251 056、544 398、1 053 231、1 284 451、2 565 852、4 991 055，以峰面積為縱坐標(Y)，對照品濃度(μg/mL)為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=48 348X+42 109；R=0.999 9。表明蘆丁峰濃度在5.14～102.8 μg/mL之間呈良好的線性關系。

2.2 精密度試驗

精密吸取中間25.70 μg/mL濃度的對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，分別為1 218 910、1 211 605、1 220 018、1 215 458、1 217 653、1 216 723、1 216 728，RSD為0.24%，測定結果表明儀器精密度良好。

2.3 重復性試驗

取同一批號樣品各6份，按上述方法測定。蘆丁含量分別為22.41%、22.46%、22.37%、22.49%、22.33%、22.53%，平均值為22.43%，RSD為1.26%(n=6)，說明該法處理樣品，重復性較好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

精密量取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進行測定，對主要色譜峰面積進行考察，RSD為0.39%，結果表明待測樣品在24 h內穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率試驗

取上已測定含量的樣品6份，每份約0.1 g，精密稱定,置于6個10 mL的容量瓶中，加入蘆丁對照液(0.124 g/L)各0.8、0.8、1.0、1.0、1.2、1.2 mL，按上述方法制備，進行測定。并計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率結果

2.6 待測樣品溶液含量測定

按1.2.3節(jié)的方法制備樣品溶液，在1.2.2節(jié)色譜條件分別按照0、6、12、24、36月測定不同處理方式樣品中蘆丁的含量，每個樣品測定3次，取平均值，結果見表2。

表2 不同處理方式槐米中蘆丁含量測定結果

從表2來看，在放置24個月及之前，槐米5種貯存方法蘆丁含量均高于藥典標準，放置36個月槐米一般貯存方法蘆丁含量明顯低于藥典規(guī)定標準，真空室溫法蘆丁含量臨界藥典標準，其他3種貯存方法蘆丁含量均高于藥典標準，由此看出槐米在一般貯存條件下在2年內可以正常使用，真空低溫和殺酶法在3年內正常使用。在真空低溫和殺酶法3種方法中，殺酶法雖然穩(wěn)定性較真空低溫法略好，但增加了操作程序和必要的設備，從經濟適用性考慮真空低溫法是最合適的貯存方法。

3 結論與討論

在兩種殺酶法中，分別對乙醇的濃度，選擇95%、90%、85%、80%，燜潤時間，選擇10、20、30、40 min，氣蒸時間選擇1、3、5、7 min進行了單因素考察。結果表明,乙醇濃度95%，燜潤時間30 min，氣蒸3 min較好，乙醇濃度越低，干燥時間延長；燜潤或氣蒸時間過短，殺酶效果不好，時間太長造成浪費，還可能影響槐米品質。

中藥材和中藥飲片往往含有大量的多糖類、蛋白質和脂肪等成分，容易受到自然環(huán)境中水分、溫度、生物及空氣等因素影響產生霉變、蟲蛀或走油等變化影響其外觀和質量。針對以上情況，《中國藥典》對中藥材和飲片貯存方法規(guī)定主要控制基本條件，如溫度、水分及光等[12]，適用大多數藥材。但是中藥材和中藥飲片活性成分含量一般較低，尤其一些含有苷類、酚類、醌類、揮發(fā)油等不穩(wěn)定成分的中藥材和中藥飲片，更易受到內外因素影響，從而使有效成分含量降低，但有的在外觀上沒有明顯的變化，這樣可能從中藥性狀上導致誤判是合格的進而在臨床上繼續(xù)使用，影響治療效果。因此，不管是中藥生產過程，還是經營和使用過程，除了藥典規(guī)定貯存方法以外，還需要根據中藥材和中藥飲片的具體的活性成分穩(wěn)定性主要影響因素進行研究，優(yōu)化最佳的貯存方式。

由于當前國家對中藥材和中藥飲片還沒有實行有效期管理[13]，在規(guī)定的貯存方法下無明確的使用期限，會使其缺少有效監(jiān)管，可能在較長時間段一直使用，易導致有效成分含量達不到國家標準，不能在臨床發(fā)揮應有的治療作用，影響臨床效果，最終對中醫(yī)藥的發(fā)展也會產生一定的負面影響。所以國家要首先針對一些有效成分穩(wěn)定性差的中藥材和中藥飲片試行有效期管理，加強使用過程監(jiān)管，探索科學合理的效期管理模式，這樣既能保證中藥材和中藥飲片質量穩(wěn)定性，也為后期的中藥材和中藥飲片普遍性進行效期管理提供經驗。