新生兒ABO溶血病微柱凝集法放散試驗(yàn)中放散液劑量?jī)?yōu)化研究*

屈柯暄，周麗華，王淑霞，呂孟興

(1.昆明市兒童醫(yī)院輸血科，昆明 650228；2.昆明市婦幼保健院檢驗(yàn)科，昆明 650031)

新生兒溶血病(hemolytic disease of the newborns，HDN)主要是指母嬰血型不合引起的新生兒同種免疫性溶血性疾病，在我國(guó)以母嬰ABO血型不合導(dǎo)致的ABO溶血病(ABO-HDN)最多見(jiàn)。該病的診斷主要依靠血型血清學(xué)檢查，放散試驗(yàn)陽(yáng)性是確診新生兒溶血病最重要的依據(jù)[1-2]。由于新生兒血液的特點(diǎn)(血型抗原表達(dá)數(shù)量少及發(fā)育不完全，血漿抗體效價(jià)低等)，在日常工作中放散試驗(yàn)往往出現(xiàn)較弱的陽(yáng)性結(jié)果，與患兒臨床癥狀不相符；部分患者臨床癥狀符合新生兒溶血病，或按照新生兒溶血病治療效果好，放散試驗(yàn)結(jié)果卻為陰性，給臨床早期診治帶來(lái)極大困擾。為提高放散試驗(yàn)的陽(yáng)性檢出率，為臨床早診斷早治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，降低ABO-HDN對(duì)新生兒造成的損害，我們采用目前敏感度高、特異度強(qiáng)的微柱凝集法 (microcolumn gel test，MGT) 對(duì)臨床診斷為ABO-HDN的新生兒血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)微柱凝集卡反應(yīng)腔容量，每個(gè)血標(biāo)本同時(shí)選擇三種不同劑量的放散液進(jìn)行平行試驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2018年1～9月，以黃疸或高膽紅素血癥收入三級(jí)甲等兒童醫(yī)院的新生兒患者869例，排除母親和新生兒血型相同的病例257例；排除不規(guī)則抗體引起的新生兒HDN患者5例；排除其它原因(感染、窒息、母乳性黃疸等)引起的高膽紅素血癥的患兒166例，最終選取母嬰ABO血型不合、出生后24 h內(nèi)出現(xiàn)黃疸或高膽紅素血癥并迅速發(fā)展，按照ABO-HDN治療效果好的新生兒441例，采集患兒EDTA抗凝血標(biāo)本3 ml備用。新生兒高膽紅素血癥診斷參考文獻(xiàn)[3]；HDN診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[4]。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑耗材：ABO血型反定型試劑盒(人血紅細(xì)胞)、不規(guī)則抗體檢測(cè)試劑(人血紅細(xì)胞)、低離子強(qiáng)度鹽溶液、ABO，RhD血型定型檢測(cè)卡(單克隆抗體)、ABO，RhD血型檢測(cè)卡(微柱凝集)、抗人球蛋白檢測(cè)卡(不規(guī)則抗體篩檢)，以上試劑均由長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；昆明南疆制藥0.9 g/dl氯化鈉注射液；泰州科健醫(yī)療用品有限公司12*100mm玻璃試管；泰州為爾康醫(yī)療用品有限公司2 ml一次性塑料吸管。

1.2.2 儀器設(shè)備：長(zhǎng)春博研科學(xué)儀器有限公司TD-3A型血型血清學(xué)用離心機(jī)、FYQ型免疫微柱孵育器；安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司LC-10C低速離心機(jī)；日本Kubota公司KA-2200血型血清學(xué)專(zhuān)用離心機(jī)；上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司HH-W21-600S型電熱恒溫水浴箱；Eppendorf移液器。

1.3 方法 納入研究的441例新生兒血液標(biāo)本，均采用微柱凝集法進(jìn)行放散試驗(yàn)，試驗(yàn)操作參照《輸血技術(shù)操作規(guī)程(輸血科部分)》[5]及試劑盒說(shuō)明書(shū)。根據(jù)微柱凝膠卡反應(yīng)腔容量(約200 μl)，每個(gè)血標(biāo)本均同時(shí)選擇低(25 μl)，中(50 μl)，高(100 μl)三種劑量的放散液進(jìn)行平行試驗(yàn)，操作步驟：①取微柱凝膠抗人球蛋白檢測(cè)卡一張 ，做好25，50，100 μl標(biāo)記。用低離子強(qiáng)度鹽溶液將ABO血型反定型試劑盒(人血紅細(xì)胞)配成0.8 ml/dl～1 ml/dl濃度，分別加入微管中，各50 μl。②按標(biāo)記劑量逐一加入制備好的放散液，最后一管加入末次洗滌液50 μl。③置37℃免疫微柱孵育器，孵育15 min。TD-A型血型血清學(xué)專(zhuān)用離心機(jī)離心5 min，取出，觀察結(jié)果。④凝集強(qiáng)度判定同檢測(cè)卡操作說(shuō)明書(shū)結(jié)果解釋部分，見(jiàn)圖1。⑤放散試驗(yàn)結(jié)果判讀[6]參照表1。

表1 放散試驗(yàn)結(jié)果判讀

注：“+”代表陽(yáng)性，包括凝集強(qiáng)度為±，1+，2+，3+，4+的凝集；“-”代表陰性。

圖1 凝集結(jié)果判定與ABO血型反定型

將試驗(yàn)結(jié)果按照三種劑量分為25 μl組，50 μl組和100 μl組。計(jì)算三組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的陽(yáng)性百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，收集的三種劑量試驗(yàn)結(jié)果屬于計(jì)數(shù)資料，用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05表示陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)P<0.001表示陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義，比較三種劑量放散液陽(yáng)性檢出率，得到最佳放散液劑量。

2結(jié)果

2.1 2018年1～9月納入研究的新生兒基本情況統(tǒng)計(jì) 見(jiàn)表2。

表2 研究對(duì)象基本情況

2.2 不同劑量放散液陽(yáng)性檢出率的比較 見(jiàn)表3。在臨床診斷為ABO-HDN的441例新生兒血液標(biāo)本中，三種劑量放散液陽(yáng)性檢出率為82.09%，82.77%和99.55%。25 μl和50 μl兩組陽(yáng)性檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；25 μl和100 μl兩組陽(yáng)性檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(P<0.001)；50 μl和100 μl兩組陽(yáng)性檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(P<0.001)。

表3 不同劑量放散液陽(yáng)性檢出率比較

注：a代表25 μl組和50 μl組比較；b代表50 μl組和100 μl組比較；c代表25 μl組和100 μl組比較。

3討論ABO-HDN是兒科最常見(jiàn)的急性溶血性疾病，引起的高膽紅素血癥一般在出生后24 h內(nèi)出現(xiàn)并迅速發(fā)展，引起膽紅素腦病或繼發(fā)性核黃疸，對(duì)新生兒造成永久性神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育損傷，由此可見(jiàn)ABO-HDN引起的潛在危險(xiǎn)性不容忽視[1，7-8]。但是由于新生兒血液特點(diǎn)(血型抗原表達(dá)數(shù)量少及發(fā)育不完全，血漿抗體效價(jià)低等)，同時(shí)溶血性抗體隨疾病進(jìn)展而逐漸消耗等原因，可能造成確診疾病的放散試驗(yàn)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，給臨床早期診斷帶來(lái)困擾。

本研究收集三級(jí)甲等兒童醫(yī)院近10個(gè)月的黃疸或高膽紅素血癥新生兒病例資料869例，通過(guò)排除法，最終得到符合研究條件的新生兒441例。在統(tǒng)計(jì)病例資料時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)有64.6%的新生兒在1～6天的日齡范圍內(nèi)出現(xiàn)明顯的黃疸或高膽紅素血癥等臨床癥狀；有75.7%的新生兒靜脈血膽紅素值在201～400 μmol/L的較高水平，說(shuō)明ABO-HDN疾病進(jìn)展快，膽紅素水平高，容易引起膽紅素腦病或繼發(fā)性核黃疸，嚴(yán)重危害新生兒健康。因此，對(duì)ABO-HDN放散試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化研究有重要臨床意義。

有文獻(xiàn)報(bào)道，增加放散液的劑量，可以提高放散試驗(yàn)的陽(yáng)性檢出率，放散液增加到75 μl時(shí)，陽(yáng)性檢出率提高到73.19%[9]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道微柱凝集法進(jìn)行新生兒溶血病血清學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)，敏感度高，特異度強(qiáng)，有助于提高新生兒溶血病的陽(yáng)性檢出率[10-12]。為了提高ABO-HDN放散試驗(yàn)的陽(yáng)性檢出率，我們選擇美國(guó)血庫(kù)協(xié)會(huì)[13]、英國(guó)血液標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的，有助于提高新生兒溶血病陽(yáng)性檢出率的微柱凝膠抗入球蛋白法(MGT)方法進(jìn)行放散試驗(yàn)的優(yōu)化研究。根據(jù)微柱凝集卡反應(yīng)腔的容量(約200 μl)，設(shè)計(jì)低、中、高三種劑量放散液進(jìn)行平行試驗(yàn)，結(jié)果顯示：在臨床診斷為ABO-HDN的441例患兒中，25 μl放散液組有79例結(jié)果表現(xiàn)為假陰性、未被檢出；50 μl放散液組有76例結(jié)果表現(xiàn)為假陰性、未被檢出；而100 μl放散液組只有2例結(jié)果表現(xiàn)為假陰性、未被檢出。將3個(gè)劑量組陽(yáng)性檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，我們發(fā)現(xiàn)100 μl組陽(yáng)性檢出率明顯高于其它劑量組，檢驗(yàn)效果最佳。其次，在研究中我們發(fā)現(xiàn)增大放散液劑量能有效增強(qiáng)凝集強(qiáng)度。當(dāng)25 μl和50 μl放散液組試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性時(shí)，凝集強(qiáng)度較弱，多為±，1+，2+；使用100 μl劑量放散液時(shí)，凝集強(qiáng)度較強(qiáng)，多為3+至4+。100 μl組放散液檢測(cè)結(jié)果為較弱的1+或±時(shí)，25 μl和50 μl組檢測(cè)結(jié)果就會(huì)出現(xiàn)假陰性等漏檢的情況。我們分析多是因?yàn)樾律鷥貉涂乖磉_(dá)數(shù)量少及發(fā)育不完全，其結(jié)合的IgG類(lèi)血型抗體少，經(jīng)過(guò)熱放散后放散液中IgG抗體效價(jià)低導(dǎo)致。

綜上所述，在ABO-HDN微柱凝集法放散試驗(yàn)中，選取100 μl劑量放散液，試驗(yàn)效果好、陽(yáng)性檢出率高、凝集強(qiáng)度大，能有效提升放散試驗(yàn)臨床診斷價(jià)值，為早期ABO-HDN診斷提供有力的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，減輕溶血病對(duì)新生兒造成的嚴(yán)重危害。同時(shí)，為新生兒溶血病血清學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序的制定提供參考依據(jù)。