19A-ST320肺炎鏈球菌引起兒童急性中耳炎的實(shí)驗(yàn)室及臨床特征分析*

雷 磊，李 倩，賈 虎

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院 a.耳科；b.超聲科，陜西延安 716000)

急性中耳炎(acute otitis media，AOM)是中耳黏膜的急性化膿性炎癥，好發(fā)于嬰幼兒，治療不及時(shí)可導(dǎo)致患者鼓膜穿孔引起患耳流膿及聽力下降。肺炎鏈球菌是AOM最常見的致病菌之一，19A-ST320肺炎鏈球菌是目前最常見的血清及序列分型，在未接種7價(jià)肺炎球菌疫苗(pneumococcal 7-valent conjugate vaccine，PCV7)的人群中，該類型所占比例更高[1-3]。既往研究表明19A-ST320肺炎鏈球菌具有高毒性和較強(qiáng)的抗生素抗性，即使使用高劑量的β-內(nèi)酰胺抗生素進(jìn)行治療，19A-ST320肺炎鏈球菌引起的兒童AOM相關(guān)癥狀持續(xù)時(shí)間也較長[4-5]。本研究旨在探究19A-ST320肺炎鏈球菌引起的兒童AOM的臨床特征及抗菌治療效果。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2013年12月～2016年11月期間于延安大學(xué)附屬醫(yī)院住院治療的AOM患兒的中耳液(middle ear fluids，MEF)用于細(xì)菌培養(yǎng)，采集前所有患兒均未接受抗生素治療。鼓膜穿刺由耳鼻咽喉科醫(yī)師判斷并執(zhí)行；自發(fā)性鼓膜穿孔的患者，在穿孔24 h內(nèi)獲得拭子?？股厥褂檬繁欢x為在招募事件之前的3個(gè)月內(nèi)接觸過抗生素。通過審查兒童初級(jí)保健者提供的病歷來獲得兒童的免疫接種記錄。本研究共納入117例檢出肺炎鏈球菌菌株的患兒，根據(jù)血清分型和多位點(diǎn)序列分型將所有受試者分為19A-ST320組(69例)和非-19A-ST320組(48例)。

1.2 試劑和儀器 哥倫比亞血平板(重慶龐通公司)；VITEK-2全自動(dòng)微生物分析儀(法國梅里埃公司)，DM2000顯微鏡(德國徠卡公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國伯樂公司)，棋盤式分型系統(tǒng)試劑盒(丹麥國家血清研究所)，QIAamp DNA Mini kit核酸提取試劑盒(德國凱杰公司)，肺炎鏈球菌血清分型引物[生工生物(上海)股份有限公司]，Taq DNA聚合酶(美國賽默飛世爾科技有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離鑒定：用無菌拭子對(duì)每個(gè)MEF樣品進(jìn)行取樣并保存在瓊脂凝膠中，將其置于微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。用標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)方法鑒定肺炎鏈球菌分離株，包括革蘭氏病菌形態(tài)學(xué)、光學(xué)敏感性、膽汁溶解度、抗原性檢測及生物化學(xué)方法。

1.3.2 血清分型檢測：采用特異性血清莢膜膨脹試驗(yàn)法檢測肺炎鏈球菌的血清分型，挑取單菌落制成菌懸液(濃度約為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，取3 μl放置于載玻片上，分別加入3 μl縱列和橫行分型血清池，與菌懸液充分混勻，再加入一接種環(huán)0.1 g/dl的亞甲藍(lán)溶液與抗血清混勻1 min，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察是否有莢膜或凝集出現(xiàn)。

1.3.3 多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence types，MLST)檢測：MLST引物和方法條件參見http：//spneumoniae.mlst.net，以肺炎鏈球菌基因組的7個(gè)管家基因(aroE，gdh，gki，recP，spi，xpt和ddl)作為目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。序列分析使用DNA star軟件，將序列提交至MLST數(shù)據(jù)庫(http：//spneumoniae.ml-st.net)可獲得相應(yīng)的肺炎鏈球菌序列型(sequence type，ST)。

1.3.4 藥物敏感試驗(yàn)：按2018年CLSI推薦的MIC法和E-test法進(jìn)行[6]。采用法國梅里埃VITEK-2全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行試驗(yàn)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：按CLSI 2018進(jìn)行判斷。

2結(jié)果

2.1 一般臨床資料 本研究所收集的MEF樣本共來自117例AOM患兒，其中男性59例(50.4%)，女性58例(49.6%)；中位年齡為39.9個(gè)月(范圍為4～71月)，其中>60個(gè)月以上兒童的有24例(20.5%)，25～60個(gè)月的兒童有52例(44.4%)，13～24個(gè)月的兒童有28例(23.9%)，≤12個(gè)月的兒童有13例(11.1%)；通過鼓膜穿刺獲得標(biāo)本55例(47.0%)，通過收集從耳朵排出的膿液獲得標(biāo)本62例(53.0%)。

2.2 血清型分析及MLST分析 本組樣本共檢出8種血清型，包括19A，19F，3， 23F，14，15A，35B和6B，其中19A最常見，共有82例，占70.1%；共檢出21種序列型，包括ST180，ST236，ST271，ST320，ST1464，ST7123，ST83，ST873，ST2652，ST3111，ST3164，ST1465，ST8525，ST13，ST2108，ST81，ST242，ST76，ST90，ST63和ST558，其中以ST320最常見，共73例，占62.4%。將兩種分型方式相結(jié)合，所有樣本中共有19A-ST320肺炎鏈球菌分離株69例(59.0%)，非-19A-ST320肺炎鏈球菌分離株48例(41.0%)。

2.3 兩組臨床特征比較 見表1。兩組患兒在發(fā)病年齡、發(fā)病年份及鼓膜自發(fā)性破裂發(fā)生率方面的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，19A-ST320組AOM患兒年齡分布較非-19A-ST320組更低，2013～2014年發(fā)病患兒比例更低，鼓膜自發(fā)性破裂發(fā)生率更高，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。兩組在性別、疫苗接種、抗生素使用、發(fā)熱時(shí)長、乳突炎及肺炎發(fā)病率方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.4 抗生素敏感性 見表2。本研究所有菌株對(duì)左氧氟沙星、莫西沙星和萬古霉素均敏感；對(duì)紅霉素和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的耐藥率分別為98.29%和85.47%；對(duì)青霉素的耐藥率為21.37%；對(duì)阿莫西林和頭孢噻肟的耐藥率分別為67.52%和24.79%；85株肺炎鏈球菌分離株(72.6%)對(duì)至少一種β-內(nèi)酰胺抗生素具有抗性，108珠肺炎鏈球菌分離株(92.3%)對(duì)多種藥物均具有抗性。與非-19A-ST320組比較，19A-ST320組分離株對(duì)青霉素、阿莫西林、頭孢噻肟和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的敏感度更低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.070～23.019，均P<0.05)；對(duì)氯霉素的敏感度更高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.718，P=0.000)。19A-ST320組較非-19A-ST320組具有更高的β-內(nèi)酰胺抗生素抵抗性和多藥耐藥性(χ2=25.057，12.344，均P<0.001)。

表1 兩組臨床特征比較分析[n=117，n(%)]

注：*Fisher精確概率法。

表2 抗生素敏感性分析[n(%)]

注：*Fisher精確概率法，S：敏感，R：耐藥，I：中介。

3討論流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示19A-ST320肺炎鏈球菌在許多國家AOM患者中普遍存在[1-3]，既往研究表明在AOM兒童中也觀察到19A-ST320肺炎鏈球菌的存在[5]。本研究結(jié)果顯示血清為19A、序列型為ST320的肺炎鏈球菌分型是導(dǎo)致AOM最常見的血清和序列分型，19A-ST320肺炎鏈球菌分離株在所有樣本中所占比例最高，為59%。這提示對(duì)于AOM患兒，尤其是未確定細(xì)菌分型的患兒，選擇對(duì)19A-ST320肺炎鏈球菌敏感的抗生素進(jìn)行治療可能是比較可行的。

本研究比較了19A-ST320組與非-19A-ST320組患兒的臨床特征，結(jié)果顯示19A-ST320組AOM患兒發(fā)病年齡更小，鼓膜自發(fā)性破裂率更高。鑒于既往研究報(bào)道1～2歲是兒童AOM的高發(fā)期，如不及時(shí)治療，其發(fā)展為慢性中耳炎的風(fēng)險(xiǎn)更高[7]。這提示對(duì)于年齡較小的AOM患者，更需要明確致病菌的分型，以便選擇更合適的抗生素治療方案，這對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要。

隨著抗生素的廣泛使用，肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的敏感性逐漸下降、耐藥率逐漸增加。研究表明兒童的耐藥情況比成人更嚴(yán)重[8]，但隨著PCV7的廣泛應(yīng)用及近年來抗生素臨床使用的逐漸合理化，肺炎鏈球菌的耐藥性也有所變化[9]。目前有很多對(duì)下呼吸道感染的肺炎鏈球菌耐藥監(jiān)測研究[10-12]。本研究中所涉及的菌株對(duì)左氧氟沙星、莫西沙星和萬古霉素均敏感；對(duì)紅霉素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑耐藥率均處于較高水平，約72.6%分離株對(duì)至少一種β-內(nèi)酰胺抗生素具有抗性，92.3%對(duì)多種藥物具有抗性，這與既往研究大致相符。同時(shí)本研究還比較了19A-ST320肺炎鏈球菌菌株與非-19A-ST320肺炎鏈球菌菌株的藥物敏感性；結(jié)果顯示與非-19A-ST320組比較，19A-ST320組分離株對(duì)青霉素、阿莫西林、頭孢噻肟和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的敏感度均更低，對(duì)氯霉素敏感性較高；19A-ST320組較非-19A-ST320組具有更高的β-內(nèi)酰胺抗生素抗性和多藥耐藥性。

綜上，由于AOM患兒中高耐藥性的19A-ST320肺炎鏈球菌感染比例逐漸提高，兒童宜按時(shí)接種肺炎球菌結(jié)合疫苗。癥狀嚴(yán)重的患兒應(yīng)適當(dāng)進(jìn)行鼓膜穿刺、確定致病菌分型以控制病情；還應(yīng)對(duì)19A-ST320肺炎鏈球菌進(jìn)行監(jiān)測以調(diào)整預(yù)防和治療策略。最后，本研究存在一定的局限性：本研究僅納入獲得MEF樣本的患兒，癥狀較輕的患兒沒有被納入研究，這對(duì)研究結(jié)果可能有一定的影響。