16周高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練對(duì)增齡大鼠骨骼肌ROS-AMPK-PGC-1α通路及最大攝氧量的影響

蔣中業(yè) 蘇浩 楊中亞 倪震 孔振興 于晶晶

1 北京體育大學(xué)（北京100084）

2 六盤水師范學(xué)院（貴州553004）

目前，人口老齡化問題日益嚴(yán)峻。因骨骼肌增齡性退變（sarcopenia）、體育運(yùn)動(dòng)參與的逐漸減少而導(dǎo)致的跌倒、骨折等問題是老年人生活質(zhì)量下降的重要因素[1]。骨骼肌增齡性退變是由年齡增長(zhǎng)引起的中老年人骨骼肌質(zhì)量減少與代謝能力下降的現(xiàn)象。有研究指出，除藥物干預(yù)外，專門針對(duì)中老年人群骨骼肌增齡性退變問題，制定以規(guī)律的抗阻運(yùn)動(dòng)或中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)內(nèi)容為核心的運(yùn)動(dòng)處方，來指導(dǎo)中老年人群有規(guī)律地參與體育運(yùn)動(dòng)，是改善骨骼肌增齡性退變的有效手段[2]。

Steven 等[3]研究指出，中老年人肌肉質(zhì)量與力量的改善不一定能有效改善其功能表現(xiàn)，而骨骼肌氧化能力的變化尤其是線粒體氧化供能能力對(duì)改變肌肉表現(xiàn)有重要作用[4-5]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1（peroxisome proliferators γ activated receptor coativator-1α，PGC-1α）是一種轉(zhuǎn)錄輔酶激活因子，通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。Mootha[6]、Yan[7]、Puigserver P[8]和韓雨梅[9]等研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α在線粒體數(shù)量和功能的調(diào)節(jié)中起主要作用。5′單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是細(xì)胞的能量感受器，是PGC-1α上游一個(gè)非常重要的調(diào)節(jié)因子。

Jager[10]、Carles[11]等研究表明，AMPK 可調(diào)節(jié)PGC-1α的表達(dá)從而促進(jìn)線粒體的生物合成?；钚匝醮兀╮e?active oxygen species，ROS）是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇，ROS 是AMPK 的上游激活劑[12]，其量在一定范圍內(nèi)可使骨骼肌內(nèi)AMPK得到充分的激活。當(dāng)前有研究表明，PGC-1α可被其重要調(diào)節(jié)因子AMPK活化，增強(qiáng)骨骼肌線粒體的氧化能力，進(jìn)而使機(jī)體VO2max得以提高[13-14]。高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和無氧運(yùn)動(dòng)可以有效地通過體內(nèi)ROS 的釋放來激活A(yù)MPK[15]。另有研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可有效使大鼠海馬體內(nèi)ROS含量減少同時(shí)AMPK和PGC-1α表達(dá)量增加[16]，低氧和耐力訓(xùn)練可有效延緩增齡過程中大鼠骨骼肌AMPK含量的下降[17-18]。

當(dāng)前大部分研究主要針對(duì)衰老過程中骨骼肌質(zhì)量與力量的下降，但有關(guān)增齡過程中骨骼肌氧化能力改變的研究不多。相較于中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)或抗阻訓(xùn)練等傳統(tǒng)運(yùn)動(dòng)干預(yù)手段，高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練（high intensity in?terval training，HIIT）作為一種新興的訓(xùn)練方式，擁有運(yùn)動(dòng)周期短[19]、運(yùn)動(dòng)依從性高[20]等特點(diǎn)，并可以有效地提升最大攝氧量（VO2max）[21]。本課題組前期研究表明，HIIT相比于傳統(tǒng)的中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)提升骨骼肌有氧能力及心肺耐力更為有效[22-23]。目前，有關(guān)HIIT 對(duì)骨骼肌線粒體有氧能力影響的研究主要以短期干預(yù)為主，長(zhǎng)時(shí)間干預(yù)的時(shí)序性研究較為少見。

本研究通過構(gòu)建自然增齡大鼠模型（8 月齡）并對(duì)其進(jìn)行為期16周的HIIT干預(yù)，觀察HIIT對(duì)骨骼肌ROS以及線粒體合成相關(guān)蛋白AMPK、PGC-1α 含量與VO2max的影響。探討ROS、AMPK和PGC-1α表達(dá)量與VO2max的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)而為HIIT在延緩骨骼肌增齡性退變研究中的應(yīng)用提供有價(jià)值的理論參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象分組

58 只7 月齡SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠利用數(shù)字表隨機(jī)分為：安靜組（C 組，n=29）與HIIT 組（H 組，n=29）兩組，分組時(shí)兩組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)無顯著性差異。所有大鼠均在屏障環(huán)境下喂養(yǎng)。各組大鼠進(jìn)入動(dòng)物房后進(jìn)行為期一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，其中H 組大鼠進(jìn)行為期一周的適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1 VO2max測(cè)試方案

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練開始前對(duì)所有大鼠進(jìn)行最大攝氧量（VO2max）測(cè)試，之后每隔兩周進(jìn)行一次VO2max 測(cè)試。采用動(dòng)物氣體代謝分析儀（Oxymax Deluxe System，哥倫布斯，美國(guó)）進(jìn)行遞增負(fù)荷測(cè)試。

測(cè)試原理為：每次測(cè)試之前首先采用含量為20.50%的O2和0.50%的CO2的標(biāo)準(zhǔn)氣對(duì)氧傳感器和二氧化碳傳感器進(jìn)行校正，之后進(jìn)行測(cè)試，首次數(shù)據(jù)為熱身4 min后出現(xiàn)，之后每隔30 s獲得一組新的數(shù)據(jù)。

攝氧量數(shù)據(jù)通過單位時(shí)間內(nèi)測(cè)得的O2的進(jìn)氣量和出氣量進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算方法為：攝氧量=單位時(shí)間內(nèi)O2的進(jìn)氣量-單位時(shí)間內(nèi)O2的出氣量。

大鼠達(dá)到最大攝氧量的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠在電刺激的情況下不能在跑臺(tái)上繼續(xù)跑或大鼠最大攝氧量值達(dá)到平臺(tái)或產(chǎn)生是第一次下降前的攝氧量數(shù)值。測(cè)試的運(yùn)動(dòng)方案根據(jù)Leandro 等[24]的研究進(jìn)行改良，具體安排見表1：

表1 大鼠VO2max測(cè)試方案

1.2.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

C組：不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)，采用自由采食和飲水，喂養(yǎng)天數(shù)與H組一致。

H組：采用HIIT 運(yùn)動(dòng)方式進(jìn)行50 min/天，5天/周，共16周的運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)方案見表2：

表2 HIIT運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

干預(yù)前對(duì)H組大鼠進(jìn)行VO2max測(cè)試，依此來制定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，之后根據(jù)每?jī)芍躒O2max 測(cè)試的結(jié)果對(duì)運(yùn)動(dòng)速度進(jìn)行調(diào)整。

1.3 取材

首次VO2max測(cè)試后以及干預(yù)的第8周、第16周最大攝氧量測(cè)試結(jié)束后24 小時(shí)進(jìn)行取材。取材安排見表3：

表3 大鼠取材安排

采用2%戊巴比妥鈉（劑量為0.25～0.5 g/kg 體重）腹腔注射麻醉大鼠后，固定其四肢及頭部，對(duì)其左右側(cè)后腿比目魚肌進(jìn)行切割后由鋁箔紙包埋后放入－80℃冰箱保存以備用于AMPK 和PGC-1α信號(hào)因子蛋白含量的測(cè)試。

1.4 測(cè)試指標(biāo)及方法

1.4.1 采用Western Blot 技術(shù)測(cè)試比目魚肌AMPK 和PGC-1α蛋白表達(dá)量

將之前儲(chǔ)存于－80 ℃保存的各組大鼠50 mg 比目魚肌取出，分別迅速投入之前準(zhǔn)備好的EP 管中，冰水浴環(huán)境下勻漿20 s 兩至三次。冰浴環(huán)境靜置30 min 后，于4 ℃環(huán)境下、以12 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心3 min，取上清。使用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒（23227，Ther?moScientific，Rockford，Illinois，USA）測(cè)定各組大鼠比目魚肌樣品的蛋白濃度。用酶標(biāo)儀37℃孵育30 min，30 min 后在562 nm，含量設(shè)置為225（25 μL 標(biāo)準(zhǔn)液+200 μLA.B 工作液）處讀數(shù)，得出OD 值。將讀出數(shù)導(dǎo)出數(shù)據(jù)，進(jìn)行計(jì)算，得出樣本配方。按照配方進(jìn)行配制樣本，按照比例加入裂解液（4×）和樣品緩沖液（NP0007，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），將濃度調(diào)為一致，完成后置于70 ℃環(huán)境中變性10 min。

蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot，WB）采用1X 的電泳緩沖液及NuPAGE?Novex 12% Bis-Tris Gel 預(yù)制膠加入之前制備好的骨骼肌樣品，加入充滿電泳緩沖液的電泳槽先后進(jìn)行25 min 90 V/300 mA 和60 min 110 V/500 mA的電泳，隨后按照蛋白分子量所在位置進(jìn)行切膠，再制作轉(zhuǎn)膜三明治（順序依次為：濾紙、膠、甲醇活化后的膜、濾紙）進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜緩沖液濃度：Tris 3.03 g/L、甘氨酸14.41 g/L、甲醇200 mL/L、蒸餾水；300 mA 條件下轉(zhuǎn)膜），轉(zhuǎn)膜時(shí)間因相應(yīng)蛋白分子量不同而有差異，轉(zhuǎn)膜完成后進(jìn)行BSA（Albumin from bo?vine serum 牛血清蛋白）封閉，孵育一抗（Anti-AMPK Ab80039，Anti-PGC1 alpha Ab54481，Anti-Tublin Ab15246，稀釋比例均為1∶1000）封閉過夜，隔天用TBST 洗滌三次（每次手搖三遍并在搖床上搖10 mins），之后可酌情回收一抗，然后進(jìn)行二抗（羊抗兔Ab6721稀釋比例1∶10000；羊抗鼠Ab97023 稀釋比例1∶10000）的孵育（至少1小時(shí)）之后用TBST洗滌三次，最后均勻滴加發(fā)光液曝光條帶。條帶分析中，以基礎(chǔ)狀態(tài)組作為參考對(duì)照，運(yùn)用Image Lab 4.0對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析得到個(gè)樣本蛋白含量的相對(duì)值。

1.4.2 骨骼肌ROS測(cè)試方法

使用GENMED 試劑盒（GMS10016.3，GENMED Scientific，Arlington，USA）進(jìn)行骨骼肌ROS 含量測(cè)試：實(shí)驗(yàn)開始前將GENMED 染色液（Reagent B）至于冰槽中融化，將GENMED稀釋液（Reagent C）放入37℃恒溫水浴槽加熱。然后將12.5 μL Reagent B 與2.5 μL Reagent C混勻呈染色工作液，至于暗室備用。之后用5 mL GENMED 清理液（Reagent A）將組織浸泡15 s后用無菌綿紙將組織吸干。將組織剪碎后加入5 mL預(yù)冷的GENMED 稀釋液（Reagent C）漩渦震蕩5 s，充分混勻后即可放入預(yù)冷的組織勻漿器。勻漿后將所有組織勻漿物移入15 mL 錐形離心管至于冰槽中備用。取10 μL 組織勻漿物或GENMED 稀釋液（Reagent C）加入16 孔板，并加入190 μL 之前配好的GENMED 染色工作液?；靹蚝螅湃?7℃恒溫水浴槽避光孵育20 min 后即刻放入EnVision 多功能酶標(biāo)儀（PerkinElmer，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)試。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有結(jié)果均表示為平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差的形式。所得VO2max 及其所對(duì)應(yīng)跑速、ROS 和WB 數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。測(cè)試條帶采用Image Lab 4.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，因大鼠來源于同一均一總體，基因條件與生活環(huán)境一致，故各組隨機(jī)抽樣測(cè)試值均可視作為該組的重復(fù)測(cè)量，因此所得數(shù)據(jù)組內(nèi)兩兩對(duì)比采用單因素方差分析進(jìn)行處理，組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，設(shè)定顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠VO2max及跑速結(jié)果

由表4 可知，16 周增齡過程中，C 組與H 組大鼠VO2max 均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。但在最后一次VO2max 測(cè)試時(shí)C 組大鼠VO2max 水平較基礎(chǔ)狀態(tài)下降幅度達(dá)到了48.9%，而H 組大鼠VO2max 較基礎(chǔ)狀態(tài)下降幅度僅37.4%。其中C 組大鼠在14 和16 周時(shí)的VO2max 顯著低于基礎(chǔ)狀態(tài)，H組大鼠在第6、14和16周時(shí)顯著低于基礎(chǔ)狀態(tài)；16周時(shí)C組和H組大鼠間VO2max水平未出現(xiàn)顯著性差異。

表4 各組大鼠VO2max測(cè)試結(jié)果（mL/kg/hr）

由表5可知，16周增齡過程中，C組VO2max所對(duì)應(yīng)跑速呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。H 組大鼠VO2max 對(duì)應(yīng)跑速呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，其跑速在8 周和16 周時(shí)均高于基礎(chǔ)狀態(tài)（P＜0.05），且H 組VO2max 對(duì)應(yīng)跑速在第8 周和第16周高于C組（P＜0.05）。

表5 各組大鼠VO2max對(duì)應(yīng)跑速結(jié)果比較（m/min）

2.2 各組大鼠骨骼肌ROS含量結(jié)果

由表6可知，16周增齡過程中C組和H組大鼠骨骼肌ROS 表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在8 周和16 周時(shí)C 組和H 組大鼠ROS 含量均高于基礎(chǔ)值（205.33 ± 47.61 vs 91.25 ± 7.95；170.67 ± 34.31 vs 91.25 ± 7.95，P＜0.05），且16 周時(shí)ROS 表達(dá)量顯著高于8 周（423.33 ±80.75 vs 205.33 ± 47.61；372.67 ± 15.04 vs 170.67± 34.31，P＜0.05）。第8周和第16周時(shí)C組與H組相比兩組之間并無顯著性差異。但通過趨勢(shì)來看，8 周和16周時(shí)H組ROS含量始終低于同時(shí)期的C組。

表6 各組大鼠ROS結(jié)果比較

2.3 各組大鼠骨骼肌AMPK及PGC-1α蛋白表達(dá)量結(jié)果

由表7與圖2可知，16周增齡過程中C組AMPK表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且在第8和第16周時(shí)AMPK表達(dá)量顯著低于基礎(chǔ)值（0.73 ± 0.23 vs 1.00 ± 0.00；0.53 ±0.24 vs 1.00 ± 0.00，P＜0.05）。經(jīng)過16 周干預(yù)，H 組AMPK表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)；干預(yù)的第8周、第16周AMPK表達(dá)量均顯著高于C組（1.20 ± 0.24 vs 0.73 ± 0.23；0.71 ± 0.35 vs 0.53 ± 0.24，P＜0.05）。

圖2 各組大鼠AMPK蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果的電泳條帶

表7 AMPK含量測(cè)試結(jié)果比較

由表8 可知，16 周增齡過程中C 組大鼠骨骼肌PGC-1α表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)且在16 周時(shí)PGC-1α表達(dá)量低于基礎(chǔ)值（P＜0.05）。16周HIIT干預(yù)過程中H組大鼠骨骼肌PGC-1α表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，第16 周PGC-1α表達(dá)量低于第8 周（P＜0.05），但第16周與基礎(chǔ)狀態(tài)相比并無顯著性下降。在干預(yù)至第16周時(shí)，H 組大鼠骨骼肌PGC-1α表達(dá)量高于C 組（P＜0.05）。

表8 各組大鼠PGC-1α含量測(cè)試結(jié)果比較

兩組均出現(xiàn)APMK 蛋白表達(dá)量下降早于PGC-1α的變化，但C組下降更為明顯，干預(yù)結(jié)束后H組上述兩項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于C組（P＜0.05）。

3 分析與討論

3.1 16周HIIT干預(yù)對(duì)ROS含量的影響

隨著機(jī)體年齡的增加，在衰老過程中機(jī)體線粒體自噬水平也不斷發(fā)生變化。線粒體的呼吸鏈能生成ROS，并且占機(jī)體ROS 產(chǎn)生的絕大部分。Fulle 等[13，25]的研究認(rèn)為，ROS 造成的氧化損傷與骨骼肌增齡性退變的發(fā)生也有密切的關(guān)系。在骨骼肌衰老的過程中ROS 會(huì)不斷產(chǎn)生，使骨骼肌的氧化損傷程度大大增加[26]。ROS是AMPK的上游激活劑，其量在一定范圍內(nèi)可使骨骼肌內(nèi)AMPK 得到充分的激活，但一但過量就會(huì)造成骨骼肌線粒體的損傷進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌的增齡性退變[27]。

本研究中C組大鼠ROS隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)了持續(xù)上升的趨勢(shì)。H組大鼠和C組相比，ROS同樣呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，但明顯上升量較小。8周時(shí)H組大鼠體內(nèi)的ROS 被有效清除，使得H 組ROS 處于適當(dāng)水平，C組的ROS在16周時(shí)高于H組，這種情況表明，運(yùn)動(dòng)可以對(duì)延緩大鼠骨骼肌內(nèi)ROS的堆積產(chǎn)生良性作用。相關(guān)研究表明，耐力運(yùn)動(dòng)和遞增負(fù)荷訓(xùn)練可以有效促進(jìn)線粒體能量合成并使衰老細(xì)胞中的ROS得到清除[5，14，28，29]，這與本研究中ROS的變化規(guī)律基本一致。但值得注意的是，16 周時(shí)H 組ROS 含量相較于8 周時(shí)上升率為119%，而16 周時(shí)C 組相較于8 周時(shí)上升率則為106%。在8-16 周過程中H 組ROS 的上升幅度較C 組更大，可能是由于此時(shí)的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相較于此時(shí)大鼠的年齡相對(duì)過大，過大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)使大鼠骨骼肌微循環(huán)受到損傷，從而加快了機(jī)體內(nèi)ROS的累積[30]。

綜合本研究中C組與H組ROS含量的變化可以說明，HIIT 運(yùn)動(dòng)可以對(duì)增齡過程中大鼠骨骼肌內(nèi)ROS 的累積起到一定的清除作用。

3.2 16周HIIT干預(yù)對(duì)AMPK及PGC-1α表達(dá)量的影響

AMPK 的活性受AMP/ATP 比值的調(diào)節(jié)，應(yīng)激反應(yīng)可通過減少ATP 的產(chǎn)生的或者增加ATP 的利用，使細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP 升高，從而激活A(yù)MPK[31]。故在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中，隨著能量的消耗，必定會(huì)激活A(yù)MPK。相關(guān)研究表明，線粒體蛋白質(zhì)的合成速率隨著人群老化而減慢，AMPK 在耐力運(yùn)動(dòng)中的激活似乎在衰老骨骼肌中變慢，且線粒體蛋白合成的下降在中年更為明顯[32]。本研究中，干預(yù)16 周后的C 組和基礎(chǔ)狀態(tài)相比AMPK 和PGC-1α含量有明顯的下降，這樣則確定了由于增齡導(dǎo)致大鼠骨骼肌內(nèi)AMPK和PGC1-α含量存在性變化。

本研究表明，長(zhǎng)期HIIT 運(yùn)動(dòng)對(duì)延緩大鼠骨骼肌AMPK 的增齡性退變有較為明顯的作用。但從趨勢(shì)來看8 周時(shí)相對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)值高，整體呈現(xiàn)一種先上升后下降的趨勢(shì)，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)與本實(shí)驗(yàn)的預(yù)期結(jié)果略有不同。因此分析前8周AMPK變化產(chǎn)生的原因，可能是這段時(shí)期中大鼠增齡性衰退的減少量少于HIIT運(yùn)動(dòng)對(duì)它的提升量，或者說這段時(shí)期HIIT 運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的積極作用略強(qiáng)于大鼠的增齡性退變產(chǎn)生的消極作用所致；另外也可能是由于AMPK的功能不僅與骨骼肌線粒體合成相關(guān)，還與心血管系統(tǒng)[33]以及消化系統(tǒng)[34，35]和脂肪組織[36]的氧化相關(guān)，其他組織對(duì)AMPK利用率的變化可能使骨骼肌中AMPK 含量產(chǎn)生變化所致?？梢姡瑹o論是長(zhǎng)期或是短期HIIT干預(yù)對(duì)延緩大鼠骨骼肌AMPK含量增齡性退變都有一定的的效果。低氧和耐力訓(xùn)練能使AMPK磷酸化水平提高，且8周的有氧運(yùn)動(dòng)可以延緩大鼠骨骼肌中AMPK 隨年齡增長(zhǎng)而產(chǎn)生的表達(dá)下降[17]。AMPK 是骨骼肌的能量感受器，PGC-1α在骨骼肌氧化代謝中起重要作用，AMPK作為PGC-1α的重要調(diào)節(jié)因子可活化PGC-1α，進(jìn)而增強(qiáng)骨骼肌線粒體的氧化能力[13]。PGC-1α的升高可增強(qiáng)肌肉中線粒體合成相關(guān)蛋白的表達(dá)并刺激線粒體生物合成，從而促進(jìn)線粒體周轉(zhuǎn)，清除損傷的細(xì)胞器，使線粒體保持“功能更年輕”的狀態(tài)[37]。另有研究已證實(shí)，PGC-1α的升高使增齡性退變小鼠模型退變的發(fā)生得到了有效的延緩，并且顯著延長(zhǎng)了生命周期[38]。C組和H組PGC-1α含量的變化趨勢(shì)與AMPK 變化同步，基本與本實(shí)驗(yàn)的預(yù)期研究結(jié)果相符合。

運(yùn)動(dòng)主要通過促進(jìn)骨骼肌AMPK 蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)提高PGC-1α蛋白的表達(dá)量進(jìn)而促進(jìn)線粒體的合成，即骨骼肌AMPK 的增加是PGC-1α表達(dá)增加的重要因素[39，40]。相關(guān)研究表明，耐力訓(xùn)練可使骨骼肌內(nèi)AMPK的含量增加，且AMPK含量的增加可導(dǎo)致PGC-1α表達(dá)量的上升[41]，前人研究基本與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。與AMPK 變化不同的是在16 周時(shí)H 組大鼠骨骼肌的PGC-1α的含量與8周H組相比存在明顯的下降。說明HIIT 訓(xùn)練從短期的效果來看對(duì)延緩骨骼肌PGC-1α增齡性退變的作用效果與AMPK相似，其相比于8周時(shí)的顯著性下降有可能是大鼠年齡增長(zhǎng)，HIIT運(yùn)動(dòng)對(duì)PGC-1α的增加量不足以彌補(bǔ)增齡性退變的減少量，打破原來建立的生理平衡，所以產(chǎn)生了下降。但也可能是由于PGC-1α對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練更為敏感從而使運(yùn)動(dòng)延緩PGC-1α下降的效果在16周時(shí)并不如AMPK明顯[42]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示16周的HIIT訓(xùn)練可以顯著提高大鼠骨骼肌AMPK蛋白含量從而延緩增齡大鼠骨骼肌AMPK 表達(dá)量的下降，且時(shí)間越長(zhǎng)效果越明顯，但也容易造成疲勞，但長(zhǎng)期HIIT訓(xùn)練對(duì)AMPK的影響更為穩(wěn)定。16 周H 組PGC-1α的含量均值顯著高于同時(shí)期C組，表明HIIT運(yùn)動(dòng)對(duì)延緩骨骼肌PGC-1α增齡性退變有較好的作用。綜合ROS 與AMPK 和PGC-1α的變化結(jié)果來看，在第16周時(shí)H組的ROS水平均低于同時(shí)長(zhǎng)C 組，而AMPK、PGC-1α均高于同時(shí)長(zhǎng)C 組，說明長(zhǎng)期的HIIT 訓(xùn)練可通過誘導(dǎo)AMPK/PGC-1α通路，促進(jìn)骨骼肌有氧代謝來延緩機(jī)體有氧能力的增齡性退變，但過量的ROS還會(huì)使線粒體發(fā)生去極化損傷，若機(jī)體內(nèi)ROS 持續(xù)保持較高水平則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的發(fā)生。通過對(duì)各組時(shí)序性變化的AMPK 和PGC-1α蛋白表達(dá)量的變化趨勢(shì)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示各組中AMPK 和PGC-1α蛋白表達(dá)量的變化具有顯著的相關(guān)性，符合AMPK為運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)PGC-1α蛋白表達(dá)的重要影響因素的結(jié)論，但變化幅度的差別也可能說明了AMPK并不是運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)PGC-1α蛋白表達(dá)的唯一因素。

3.3 16 周HIIT 干預(yù)對(duì)大鼠增齡過程中VO2max 及運(yùn)動(dòng)能力的影響

VO2max 是評(píng)價(jià)心肺耐力的重要指標(biāo)，其所對(duì)應(yīng)的跑速則能有效體現(xiàn)機(jī)體的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。研究表明，肌肉的氧化能力隨增齡而下降，增齡導(dǎo)致的肌肉氧化能力的下降使VO2max而下降。有氧耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)VO2max有促進(jìn)作用，MacDougall等[43]以及Made[44]認(rèn)為訓(xùn)練強(qiáng)度在60%～80% VO2max 能非常有效提高VO2max，Helgerud等[45]認(rèn)為持續(xù)8 周大強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)可顯著提高VO2max，另有研究表明，終生進(jìn)行有氧訓(xùn)練會(huì)提升骨骼肌適應(yīng)性，減緩隨著年齡增長(zhǎng)肌肉氧化能力的衰減[4]。另外，體重是影響VO2max 的重要指標(biāo)，本研究中VO2max 采用最大攝氧量的相對(duì)值（mL/kg/hr）表示，可排除體重的影響。在本研究中，VO2max 與骨骼肌AMPK 和PGC-1α的變化趨勢(shì)基本相同，但AMPK 和PGC-1α的變化幅度比VO2max 更為明顯。C 組由于大鼠自然增齡而使骨骼肌有氧能力發(fā)生退變，致使出現(xiàn)骨骼肌有氧能力相關(guān)蛋白AMPK、PGC-1α以及心肺耐力相關(guān)指標(biāo)VO2max與其對(duì)應(yīng)跑速的持續(xù)下降。C組在0～12 周之間變化沒有顯著差異，14 周后與基礎(chǔ)狀態(tài)相比出現(xiàn)顯著下降，表明VO2max在前10周內(nèi)的增齡性影響不大。H組VO2max在0～10周之間出現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(shì)。在第10周后，H組大鼠的VO2max再次出現(xiàn)降低，說明HIIT 對(duì)VO2max 的促進(jìn)作用明顯，這些現(xiàn)象均符合前人對(duì)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和VO2max 關(guān)系的研究。H 組所對(duì)應(yīng)的跑速與其VO2max 變化趨勢(shì)基本相同，前8 周顯著升高，8～16 周過程中雖有下降但其運(yùn)動(dòng)能力仍高于基礎(chǔ)狀態(tài)。運(yùn)動(dòng)12 周后H 組大鼠VO2max也開始呈下降趨勢(shì)，這可能是由于大鼠隨年齡增長(zhǎng)而產(chǎn)生的正常變化。各組大鼠在12 周飼養(yǎng)與訓(xùn)練后組內(nèi)與組間VO2max無顯著性差異，可能是由于訓(xùn)練對(duì)大鼠VO2max 的影響有限，使其VO2max 尚未在統(tǒng)計(jì)學(xué)上形成顯著性差異，但H組VO2max水平高于同期C組說明HIIT這種運(yùn)動(dòng)負(fù)荷方式對(duì)延緩大鼠增齡過程中心肺耐力的減弱可能存在一定作用。

綜上可得，增齡過程中機(jī)體VO2max的變化與骨骼肌氧化能力下降有密切聯(lián)系。長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練才能有效提高機(jī)體VO2max，且HIIT 訓(xùn)練對(duì)延緩增齡大鼠VO2max的下降和運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的衰退有一定的作用，可能是通過延緩增齡過程中AMPK 和PGC-1α的變化使骨骼肌線粒體氧化能力的下降得到了抑制，進(jìn)而延緩了增齡過程中機(jī)體VO2max和運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的下降。

4 結(jié)論

16 周HIIT 干預(yù)能有效延緩增齡大鼠VO2max 和運(yùn)動(dòng)能力的下降可能是通過延緩ROS在機(jī)體內(nèi)的堆積并延緩增齡大鼠骨骼肌AMPK 和PGC-1α蛋白表達(dá)量下降來實(shí)現(xiàn)的。