肩袖肌腱損傷動物模型的建立及初步研究

閆明童 翟申浩 褚國慶 叢文斌 于騰波

1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)科（青島266003）

2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科 3 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科

肩袖亦稱為旋轉(zhuǎn)袖，是覆蓋于肩關(guān)節(jié)前、上、后方之肩胛下肌、岡上肌、岡下肌、小圓肌等肌腱組織的總稱。肩袖的功能是在上臂外展過程中，使肱骨頭向關(guān)節(jié)方向拉緊，維持肱骨頭與關(guān)節(jié)盂正常的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)。因此，肩袖肌腱損傷（rotator cuff tendon injury）時，肩關(guān)節(jié)外展功能受限，臨床上肩袖肌腱損傷多見于岡上肌[1]。

研究肩袖損傷的動物多見有鼠、兔、羊、犬類[2-7]。大鼠關(guān)節(jié)較小，手術(shù)操作難度高，術(shù)后觀察困難；羊及狗類動物生長周期長，實驗花費高，難以大量研究。兔肩胛下肌穿過肩胛骨的一拱形凸起類似于人岡上肌穿過肩峰的結(jié)構(gòu)（圖1），因此兔肩胛下肌的解剖結(jié)構(gòu)與人的肩袖結(jié)構(gòu)更為相似。在組織學(xué)上，兔肩袖肌腱有著與人類相似的從肌腱到骨的移行區(qū)域，適合進行肩袖愈合的相關(guān)研究。因此，本研究通過建立兔肩袖損傷動物模型并驗證其可行性，進行肩袖損傷初步生物力學(xué)、組織學(xué)研究。

圖1 兔肩關(guān)節(jié)解剖

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本研究于2018年3月～8月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗室完成。40只體重2.5～3.5 kg 的成年雄性新西蘭大白兔由青島大學(xué)動物實驗中心提供；西門子核磁共振斷層掃描儀（SIEMENS Magnetom，Verio 3.0T）由青島大學(xué)附屬醫(yī)院提供；美國Instron-3300 萬能材料試驗機由青島大學(xué)提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔肩袖損傷模型建立及實驗過程

40 只成年雄性新西蘭大白兔隨機編號，選取4 只兔，其中2 只用于測試生物力學(xué)儀器，另外2 只用于調(diào)試兔肩袖MRI設(shè)備。這4只兔的實驗數(shù)據(jù)不計入實驗結(jié)果中，只用于前期準(zhǔn)備及調(diào)試工作。其余36 只大白兔選取右側(cè)肩胛下肌為實驗側(cè)，對側(cè)作為假手術(shù)對照。用3% 的戊巴比妥鈉（1 ml / kg）行耳緣靜脈緩慢推注，觀察兔的生命體征，待兔角膜反射及皮膚夾捏無反應(yīng)后視為麻醉成功。麻醉后將兔固定于動物手術(shù)臺，常規(guī)備皮、消毒、鋪無菌巾。在肩關(guān)節(jié)外側(cè)行長約2cm 的縱行切口，鈍性分離三角肌，顯露肩胛下肌肌腱在小結(jié)節(jié)上的止點（見圖2A），兔肩胛下肌止點處平均寬度為6.8 mm[8]（圖2B）。于肱骨小結(jié)節(jié)止點處銳性離斷約2～3 mm（＜50%止點處肌腱寬度）的肩胛下肌肌腱。檢查傷口無活動性出血后，逐層關(guān)閉傷口，無菌紗布覆蓋，繃帶固定。對側(cè)肢體做假手術(shù)對照，顯露肩胛下肌后不做處理，隨后逐層關(guān)閉傷口，無菌紗布覆蓋，繃帶固定。術(shù)后常規(guī)觀察直至兔自然蘇醒，常規(guī)飲食，手術(shù)切口2～3 天更換敷料，青霉素4×105 U 后肢肌注預(yù)防感染，持續(xù)3 天。術(shù)后單籠限制性飼養(yǎng)（60 cm×40 cm×50 cm），手術(shù)側(cè)及對側(cè)均不進行制動固定。

圖2 肩胛下肌損傷模型的建立

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 觀察指標(biāo)

動物模型的建立是否成功，手術(shù)操作的可重復(fù)性；術(shù)后2、4、6、8 周實驗動物恢復(fù)情況，手術(shù)切口有無感染；實驗動物肌腱愈合情況。

1.2.2.2 生物力學(xué)測試

術(shù)后2、4、6、8 周各選取5只實驗兔子，以右側(cè)肩胛下肌止點為中心，截取整塊右側(cè)肩胛下肌及近端肱骨，按相同方法獲取對側(cè)肩胛下肌。在正式實驗開始前，選取未進行任何處理的2只兔的肌腱進行預(yù)實驗，實驗標(biāo)本肌腱側(cè)采用“三明治”（砂紙-萬能膠-肌腱-萬能膠-砂紙）方法固定[9]，肱骨頭端直接固定于儀器上，確保在到達最大拉力時，肌腱撕裂部位為肌腱或腱骨結(jié)合處而非肌腱側(cè)或肱骨頭側(cè)從儀器上脫落。調(diào)整合適的固定后進行生物力學(xué)測試，減少因固定方法不當(dāng)而造成的誤差。進行生物力學(xué)實驗時，按預(yù)實驗的方法固定標(biāo)本，在美國Instron-3300 萬能材料試驗機上進行拉力測試，載荷率為0.4 mm /s，詳細觀察記錄肩胛下肌肌腱被拉斷時的加載負荷并作為最大載荷（N）。

1.2.2.3 組織病理學(xué)觀察

術(shù)后2、4、6、8周各選取3只實驗兔子，以右側(cè)肩胛下肌止點為中心，截取包括肱骨小結(jié)節(jié)組織和距肩胛下肌止點2 cm 處的肌腱組織，用于觀察肌腱愈合情況。標(biāo)本以體積分數(shù)10%甲醛溶液固定3 d，以體積分數(shù)30%甲酸溶液充分脫鈣4 周后，水沖12 h 以去除標(biāo)本中殘留的甲酸，然后以體積分數(shù)10%甲醛溶液再次固定，經(jīng)AF 液（體積分數(shù)10%甲醛溶液和體積分數(shù)95%乙醇按1∶1 的比例配制）和梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，石蠟浸蠟、包埋，制成4 μm 厚度的連續(xù)切片。分別進行HE染色、Masson染色后光鏡下觀察肩胛下肌損傷后肌腱愈合的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2.4 核磁共振（MRI）檢查

選取正常兔子2只用于實驗測試前調(diào)試核磁共振機器。待機器調(diào)整合適后，術(shù)后2、4、6、8 周各選取實驗兔子2 只，對選取的大白兔用3%戊巴比妥（ 1 ml/ kg ）耳緣靜脈注射進行麻醉，然后將其以上肢向內(nèi)的臥位平放于動物固定線圈上（圖3），放入核磁共振斷層掃描儀器中，采集肩關(guān)節(jié)處圖像。圖像采集結(jié)束后，等待兔子自然蘇醒后放回籠中飼養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，所有數(shù)據(jù)以x ± s 表示，組間均值比較采用獨立樣本t 檢驗，組內(nèi)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 核磁共振所用動物線圈及實驗動物體位

2 結(jié)果

2.1 實驗動物造模結(jié)果

除4 只未進行實驗操作的兔外，其余36 只實驗動物兔，4 只死于實驗麻醉；其余32 只術(shù)后情況良好，于手術(shù)結(jié)束自然蘇醒后開始正常進食，術(shù)后實驗兔無傷口感染及死亡。在進行手術(shù)操作建立動物模型的過程中，兔肩胛下肌解剖結(jié)構(gòu)清晰，且其止點可于肱骨小結(jié)節(jié)處找到，手術(shù)操作相關(guān)部位解剖清晰，對肩胛下肌的手術(shù)操作相對簡單易行，可以很好地模擬人肩袖肌腱損傷以及周圍因素導(dǎo)致的肩袖損傷；肩袖損傷入路及手術(shù)操作的可重復(fù)性高[8]。

2.2 生物力學(xué)測試

實驗觀察撕脫部位，各肌腱撕脫部位均位于肌腱靠近肱骨處（圖4），不存在肌腱從砂紙中撕脫或肱骨從機器上脫落。實驗側(cè)的最大載荷在2、4、6、8 周逐漸增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。實驗側(cè)術(shù)后第8周最大載荷與假手術(shù)對照側(cè)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；實驗側(cè)術(shù)后2、4、6 周的最大載荷均低于假手術(shù)側(cè)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

圖4 撕脫部位位于肌腱靠近肱骨處

表1 最大載荷比較（N，n=20）

2.3 組織病理學(xué)結(jié)果

HE染色可以大體觀察肌腱結(jié)構(gòu)，初步評價愈合情況。Masson 染色用于觀察肌腱的膠原纖維分布，有助于評估肌腱的愈合情況（圖5、6）。

術(shù)后2周，實驗側(cè)肌腱愈合不明顯，肌腱內(nèi)可見間充質(zhì)細胞增生，大量疏松結(jié)締組織和炎癥細胞浸潤，少量脂肪細胞，肌腱內(nèi)膠原纖維排列不規(guī)則；術(shù)后4周肌腱內(nèi)可見明顯脂肪浸潤，大量膠原纖維成束狀排列；術(shù)后6周肌腱膠原纖維成簇狀排列，結(jié)構(gòu)紊亂，大量成纖維細胞和膠原纖維相連，仍然存在少量脂肪細胞；術(shù)后8周，肌腱內(nèi)膠原纖維粗大而規(guī)則，排列緊密，基本恢復(fù)正常肌腱排列。

圖5 兔實驗側(cè)肌腱組織HE染色（×100）

圖6 兔實驗側(cè)肌腱組織Masson染色（×100）

2.4 核磁共振結(jié)果

術(shù)后2周，實驗側(cè)肌腱內(nèi)可見局限性信號增強影，肌腱內(nèi)結(jié)構(gòu)不規(guī)則，肌腱外形欠佳，肩關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見信號增高影；術(shù)后4周肌腱內(nèi)高信號影逐漸降低，肌腱外形不光滑，關(guān)節(jié)腔內(nèi)信號增高影逐漸減少。術(shù)后6 周肌腱內(nèi)高信號影減少，肌腱外形稍有不光滑影，關(guān)節(jié)腔內(nèi)基本無高信號影。術(shù)后8周肌腱內(nèi)基本不見高信號影，肌腱外形光滑，關(guān)節(jié)腔內(nèi)少量高信號影（圖7）。

圖7 兔實驗側(cè)肩關(guān)節(jié)MRI檢查結(jié)果

3 討論

3.1 實驗動物的選擇

以往文獻中研究肩袖肌腱損傷的實驗動物有大鼠、兔、羊和犬。大鼠岡上肌解剖結(jié)構(gòu)也存在一類似于人岡上肌肌腱通過肩峰的拱形結(jié)構(gòu)[10]，因此部分實驗選取大鼠為研究對象。但大鼠肩關(guān)節(jié)較小，手術(shù)操作難度大，術(shù)后觀察比較困難。羊及犬類實驗動物體型大，雖然肩關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與人相似，但在進行肩袖損傷模型建立術(shù)后，實驗動物需要用前足支撐活動，影響術(shù)后觀察效果；其次羊和犬類實驗動物生長周期較長，飼養(yǎng)及管理花費高。因此本研究選取繁殖快、價格相對低廉、飼養(yǎng)及管理方便的兔為實驗對象。在研究兔肩部解剖結(jié)構(gòu)與人的肩部解剖結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)[11]，兔肩胛骨解剖結(jié)構(gòu)與人存在一定差異，兔岡上肌肌腱并不存在類似于人的岡上肌肌腱穿過肩峰的部分，無法模擬人岡上肌部分損傷中存在的肩峰撞擊。而對36 只實驗兔進行手術(shù)及術(shù)后解剖發(fā)現(xiàn)，兔肩胛下肌在肱骨頭止點前方存在一個穿過由肩胛骨凸起而形成的拱形結(jié)構(gòu)的部分，止于肱骨小結(jié)節(jié)。肩胛下肌解剖位置明確，兔肩胛下肌止點可于肩關(guān)節(jié)外側(cè)手術(shù)入路在肱骨頭處尋找到，手術(shù)入路比較好選擇。肩關(guān)節(jié)處皮下脂肪含量少，周圍解剖結(jié)構(gòu)清楚，手術(shù)操作對周邊結(jié)構(gòu)影響小，不損傷肩袖其余肌肉肌腱，建立肩袖損傷模型的操作及相關(guān)手術(shù)操作的可重復(fù)性高。在組織學(xué)上兔肩袖肌腱有與人相似的從肌腱到骨的移行區(qū)域，適合于研究肩袖肌腱的愈合。

在模型制備的過程中，雖然選取兔作為動物模型可以很好地模擬人肩袖損傷，但兔在行走及跳躍時，前足會著地，在實驗中兔單籠飼養(yǎng)但并不限制其活動，因此容易造成術(shù)后肩袖肌腱因活動而導(dǎo)致的進一步損傷。但在實際飼養(yǎng)時觀察發(fā)現(xiàn)，兔常用雙下肢站立、雙上肢持物，比其他實驗動物上肢單獨活動及避免上肢負重的時間更多[12]。同時觀察兔術(shù)后活動發(fā)現(xiàn)，因手術(shù)疼痛影響，為減少上肢負重或活動引起的疼痛，兔本能的長時間站立，間接地減少因活動造成的進一步損傷，更利于觀察肩袖在損傷后的恢復(fù)情況。因此本實驗選取兔肩胛下肌來模擬人的肩袖損傷，進行肩袖損傷動物模型的相關(guān)研究。

3.2 生物力學(xué)測試

為了更好地進行測試，在選取實驗材料時，應(yīng)盡可能多地截取肩胛下肌肌腹，完整切取肱骨頭，調(diào)整合適的固定后進行生物力學(xué)測試，減少因固定方法不當(dāng)而造成的誤差。最大載荷是指在最大拉力上的拉斷載荷。本研究結(jié)果顯示，實驗側(cè)最大載荷隨著時間的延長而逐漸增加，且在前6 周實驗側(cè)最大載荷均低于假手術(shù)側(cè)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；第8 周實驗側(cè)最大載荷與假手術(shù)側(cè)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這提示損傷肌腱在8周已基本恢復(fù)其生物力學(xué)強度。兔的這一生物力學(xué)特性證實兔適用于肩袖損傷研究[8]。

3.3 組織病理學(xué)及核磁共振分析

在進行組織學(xué)染色時選取的標(biāo)本應(yīng)盡可能保留損傷部位，留取一部分肱骨小結(jié)節(jié)，以便觀察。在進行切片時盡可能切取損傷中心部位進行染色觀察。損傷2周時HE染色顯示實驗側(cè)肌腱愈合不明顯，肌腱內(nèi)可見間充質(zhì)細胞增生，大量疏松結(jié)締組織和炎癥細胞浸潤，少量脂肪細胞；Masson染色可見大量結(jié)締組織，肌腱纖維排列紊亂；磁共振顯示肌腱內(nèi)高信號影，肌腱邊緣不光滑。6周時肌腱在組織學(xué)及影像學(xué)上已趨于正常，核磁共振結(jié)果顯示肩胛下肌肌腱內(nèi)因損傷而導(dǎo)致的高信號影較少，肌腱邊緣清楚。因此，在肩袖肌腱部分損傷后，特別是損傷小、不影響活動的損傷，可先進行保守治療，6～8 周內(nèi)，肌腱有愈合傾向。但肩袖肌腱損傷不可避免會有脂肪浸潤和肌肉萎縮，本實驗未見明顯的脂肪浸潤和肌肉萎縮，推測有可能與造成的損傷小，未引起嚴重的脂肪浸潤有關(guān)。另外有研究表明，在兔的肩袖損傷實驗中，未進行處理的岡上肌損傷中，脂肪浸潤在6 周時最明顯，肌腱在12 周時基本愈合且脂肪浸潤在損傷處消失[4]。在進行肩袖損傷修復(fù)手術(shù)后，肩袖的脂肪浸潤和萎縮變性可部分逆轉(zhuǎn)[13，14]。

3.4 實驗局限性

本次實驗選取兔肩胛下肌可以更好地模擬人岡上肌穿行肩峰的這一特殊的解剖結(jié)構(gòu)，但肩胛下肌與岡上肌在功能上存在差異；另外兔肩關(guān)節(jié)基本不進行外展活動，與人的肩關(guān)節(jié)活動范圍存在一定差異，限制了肩袖損傷后的進一步研究[15]。本實驗未進行防止肩袖損傷后脂肪浸潤和肩關(guān)節(jié)粘連的研究，雖然有研究表明肩袖損傷后脂肪浸潤并不妨礙肩袖損傷的修復(fù)，但本實驗未加以證實[2，16，17]。肌腱損傷的同時多伴有神經(jīng)損傷，而本研究僅考慮肌腱的自然愈合，未考慮神經(jīng)因素對肌腱愈合的影響[18，19]。實驗樣本量較小也是影響實驗結(jié)果的因素之一。

4 結(jié)論

本實驗證實利用兔肩胛下肌建立肩袖損傷動物模型并進行相關(guān)實驗研究的可行性。生物力學(xué)、組織病理學(xué)染色觀察以及核磁共振結(jié)果顯示兔肩袖肌腱部分損傷后，6～8周基本愈合，恢復(fù)肌腱生物力學(xué)強度；肌腱纖維排列緊密，基本恢復(fù)正常的肌腱纖維排列；影像學(xué)上損傷信號基本恢復(fù)。