真鯛虹彩病毒自然感染雜交石斑魚“褐龍斑”的組織病理分析*

劉冉陽 史成銀 謝國駟 李 晨 王海波

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出 過程功能實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點實驗室 青島 266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

近年來，隨著石斑魚人工雜交苗種繁育技術(shù)的進(jìn)步，且雜交子代存在明顯的雜交優(yōu)勢，雜交石斑魚逐漸 成 為 市場的新寵(李 炎璐等,2015; 邵彥翔 等 ,2017)。褐龍斑是褐石斑魚(Epinephelus bruneus♀)與鞍帶石斑魚(E.lanceolatus♂)的雜交子代，存在明顯的雜交優(yōu)勢，是具有較大養(yǎng)殖潛力的石斑魚新品種。由于規(guī)?；B(yǎng)殖時間較短，目前國內(nèi)外尚沒有褐龍斑疾病的報道。2017年 7月，山東省某養(yǎng)殖場褐龍斑出現(xiàn)急性、大量死亡。調(diào)查褐龍斑發(fā)病情況，取瀕死魚的組織進(jìn)行電鏡切片觀察，在病魚脾、腎等組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的虹彩病毒樣顆粒。

虹彩病毒是20面體狀的大型DNA病毒，共分為5個病毒屬，其中，腫大細(xì)胞病毒屬(Megalocytivirus)的虹彩病毒是魚類的重要病原之一(Jancovichet al,2012)。依據(jù)病毒的主要衣殼蛋白(Major capsid protein,MCP)基因，細(xì)胞腫大病毒屬虹彩病毒可分類為 3大類群(基因型)，即主要感染海水魚類的真鯛虹彩病毒(Red sea bream iridovirus,RSIV)類群、主要感染淡水魚類的傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)類群和主要感染鲆鰈魚類的大菱鲆紅體病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)類群(Fuet al,2011; Kuritaet al,2012)。真鯛虹彩病毒能導(dǎo)致多種魚類發(fā)病死亡，嚴(yán)重威脅著世界魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展(Inouyeet al,1992)。因此，真鯛虹彩病毒病長期以來被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)和中國列為魚類重要疫病(Junget al,2000; Rodgeet al,1997; Wenget al,2002; Chuaet al,1994)。

本研究通過疾病調(diào)查、病魚的臨床檢查、組織病理和超微病理觀察、病原初步篩查和分子生物學(xué)鑒定，確認(rèn)感染褐龍斑的病毒為真鯛虹彩病毒，可為該病的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

發(fā)病瀕死和健康的褐龍斑均取自山東省某石斑魚養(yǎng)殖場。TSA、TCBS培養(yǎng)基購自北京陸橋生物制品有限公司，海洋動物組織DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker購自TaKaRa公司；所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 疾病調(diào)查與臨床檢查

調(diào)查養(yǎng)殖環(huán)境及病魚死亡情況；觀察病魚活動情況，對瀕死病魚進(jìn)行觀察和剖檢。

1.3 組織病理及超微病理觀察

參照史成銀(2004)的方法，取瀕死病魚和健康魚的肝、脾、腎、頭腎、鰓、心臟、胃和腸道組織制成石蠟切片和超薄電鏡切片，利用光學(xué)、透射電子顯微鏡觀察拍照。

1.4 寄生蟲觀察和細(xì)菌分離

取瀕死病魚的鰓絲、體表黏液制成水浸壓片，顯微鏡下觀察。使用病魚的肝、腎、脾接種TSA和TCBS平板后，28℃培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)菌生長情況，進(jìn)行細(xì)菌檢測。

1.5 組織DNA提取和PCR檢測

提取瀕死病魚脾、肝、頭腎和腎組織的 DNA，根據(jù)中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《真鯛虹彩病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 1675-2014)，使用引物1-F/1-R和4-F/4-R進(jìn)行PCR檢測(表1)。50 μl的 PCR 反應(yīng)體系：10×Reaction buffer(含 20 mmol/L Mg2+) 5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，20μmol/L引物各1μl，5 U/μlTaq酶 1 μl，100 ng/μl的模板 DNA 4 μl，補足超純水至 50 μl。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 2 min；94℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 60 s，共進(jìn)行 30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

表1 本研究中的PCR引物序列及其目標(biāo)產(chǎn)物大小Tab.1 Sequences of PCR primers and products length in this study

1.6 虹彩病毒MCP全長基因的擴(kuò)增

參照史成銀(2004)，用引物 MCP-iridoF和MCP-iridoR 擴(kuò)增 MCP 基因全長(表1)。50 μl的 PCR反應(yīng)體系：10×Reaction buffer (含 20 mmol/L Mg2+) 5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，20 μmol/L引物各1μl，5 U/μlTaq酶 1 μl，100 ng/μl的模板 DNA 4 μl，補足超純水至 50 μl。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 min；94℃ 2 min，57℃ 1 min，72℃ 1 min，35 個循環(huán)；最后，72℃延伸5 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果。PCR產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)有限公司從兩端單向測通，再拼接出完整的PCR產(chǎn)物序列，用Blast比對分析測序結(jié)果。

1.7 虹彩病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析

依據(jù)Blast比對結(jié)果，選取18種(株)具有代表性的虹彩病毒，從GenBank下載各病毒的MCP基因全長序列，用MEGA 7.0構(gòu)建虹彩病毒系統(tǒng)發(fā)育樹，分析、鑒定感染褐龍斑的病毒在虹彩病毒科中的分類地位。各病毒的名稱及GenBank登錄號為：ATV (NC_ 005832)、CIV (AF303741)、FLIV-JJY (AY633990)、FV3 (U36913)、GIV (AY666015)、IIV-3 (DQ643392)、ISKNV (NC_003494)、ISKNV SB04 (KY440040)、LCDV-1 (NC_001824)、LCDV-C (AY380826)、RSIV-1 (AB666328)、RSIV 2HSB (AB666318)、RSIV-8 (AB666335)、RSIV-9 (AB666336)、RSIV 10GG (AB666324)、RSIV Ehime-1 (AB080362)、RSIV TGA14 (AB666320)、TRBIV (GQ273492)。

2 結(jié)果

2.1 疾病調(diào)查與臨床檢查

褐龍斑以循環(huán)水工廠化養(yǎng)殖，發(fā)病時的水溫為28℃、鹽度為31、pH為7.5、溶氧為4.5 mg/L、養(yǎng)殖密度為1000尾/40 m3。發(fā)病初期，病魚活力明顯下降。隨病程發(fā)展，病魚反應(yīng)遲鈍、伏底，并出現(xiàn)死亡。4個發(fā)病池，日死亡率約10%，10 d內(nèi)累積死亡率達(dá)80%。

病魚為2齡魚，全長為29.5～31.5 cm，體重約為500 g。多數(shù)魚體表未見明顯異常，個別魚尾鰭有潰瘍病灶。病魚鰓絲鮮紅，無潰爛(圖1A)。解剖可見病魚空腸空胃，無明顯發(fā)炎。肝局部出血，呈現(xiàn)不均勻的顏色。脾和腎嚴(yán)重腫大、易碎，腎臟色淡(圖1B)。

2.2 組織病理觀察

圖1 患病褐龍斑Fig.1 Diseased fish

圖2 患病魚組織病理變化(標(biāo)尺為 20 μm)Fig.2 Histopathological changes in the diseased fish (Bar=20 μm)

健康魚脾實質(zhì)細(xì)胞飽滿、清晰、排列緊密(圖2A)。病魚脾組織細(xì)胞壞死，被大量紅細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)嚴(yán)重淤血。組織中填充有大量嗜堿性的腫大細(xì)胞，直徑為10～15 μm，細(xì)胞質(zhì)均一化(圖2B)。脾出現(xiàn)大量鐵血黃素沉積(圖2C)。健康魚的頭腎呈致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖2D)。病魚的頭腎組織中可見大量嗜堿性的腫大細(xì)胞(圖2E)，且組織結(jié)構(gòu)松散，大量細(xì)胞發(fā)生核固縮，紅細(xì)胞浸潤，多見細(xì)胞崩解后形成的壞死灶(圖2F)。健康魚肝臟細(xì)胞大小、形狀均一，結(jié)構(gòu)清晰排列緊密 (圖2G)。病魚肝臟細(xì)胞膜崩解，邊界模糊，細(xì)胞連成一片，造成雙核假象；細(xì)胞核腫大而核質(zhì)溶解呈透亮狀；肝血竇周圍細(xì)胞發(fā)生淀粉樣變性，胞質(zhì)呈現(xiàn)云霧狀的嗜酸性染色(圖2H)。病魚肝臟內(nèi)可見局灶性壞死，并零星出現(xiàn)嗜堿性的腫大細(xì)胞(圖2I)。健康魚的腎組織結(jié)構(gòu)飽滿、清晰(圖2J)。病魚的腎造血組織壞死、細(xì)胞核固縮；出現(xiàn)嗜堿性的腫大細(xì)胞，但數(shù)量比脾和頭腎組織中少。病魚腎小管上皮細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核空泡化(圖2K)。腎小球血管球細(xì)胞水樣變性，腎小囊腔變窄(圖2L)。健康魚鰓上皮細(xì)胞單層有序排列，次級鰓絲結(jié)構(gòu)清晰(圖2M)。病魚鰓組織結(jié)構(gòu)松散，次級鰓絲腫脹(圖2N)，且上皮細(xì)胞剝離、脫落；部分柱細(xì)胞斷裂，導(dǎo)致毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(圖2O)。健康魚心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整(圖2P)。病魚心肌纖維結(jié)構(gòu)松散、紊亂，心肌退化變性，胞質(zhì)液化呈均質(zhì)玻璃樣物質(zhì)。嚴(yán)重者心肌細(xì)胞壞死，細(xì)胞崩解留下帶狀壞死灶(圖2Q)。病魚腸組織病變不明顯；腸黏膜固有層零星出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)均一、嗜堿性的腫大細(xì)胞，細(xì)胞核固縮于細(xì)胞邊緣，或異常腫大，核質(zhì)溶解呈透亮狀(圖2R、圖2S)。病魚胃黏膜下層退化變性，細(xì)胞出現(xiàn)壞死崩解，留下不規(guī)則的壞死灶(圖2U)。

2.3 超微病理觀察

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病魚脾造血組織細(xì)胞核異染色質(zhì)增多，核膜可見但不清晰，核周隙明顯擴(kuò)張，嚴(yán)重者細(xì)胞核碎裂。細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡化，線粒體腫脹、嵴消失(圖3A)。腫大細(xì)胞胞質(zhì)中存在大量虹彩病毒樣病毒粒子，無囊膜，直徑為 130～150 nm (圖3B)。病魚頭腎造血組織中發(fā)現(xiàn)含有大量病毒顆粒的腫大細(xì)胞，且線粒體腫脹、嵴消失，細(xì)胞質(zhì)中囊泡增多；特別是腫大細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)陷形成大量樹枝狀溝回結(jié)構(gòu)(圖3C)。出現(xiàn)核固縮的凋亡小體(圖3D)。病魚肝細(xì)胞膜出現(xiàn)破損或結(jié)構(gòu)異常，核內(nèi)大部分染色質(zhì)溶解，核外形可見，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡化形成的小泡脫粒、破裂，線粒體破損；嚴(yán)重者細(xì)胞核消失，出現(xiàn)嗜鋨性髓鞘樣小體，胞內(nèi)模糊不清，結(jié)構(gòu)基本消失(圖3E、圖3F)。病魚腎小管上皮細(xì)胞核固縮或出現(xiàn)核溝，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)初級溶酶體，線粒體嵴腫脹呈管泡狀，刷狀緣發(fā)生斷裂(圖3G)。腎造血組織腫大細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)陷，核形狀異常，核仁增大(圖3H)。病魚次級鰓絲上皮細(xì)胞、柱狀細(xì)胞病變嚴(yán)重。線粒體嵴腫脹、空泡化，基質(zhì)電子密度增大；出現(xiàn)S或Y形的畸形線粒體，以及大量縱向嵴線粒體；細(xì)胞核周間隙擴(kuò)張，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡化并脫粒(圖3I、圖3J)。病魚鰓血管及白細(xì)胞中觀察到大量的病毒粒子(圖3K、圖3L)，表明病毒可經(jīng)由血液循環(huán)感染魚體各個組織。病魚心肌細(xì)胞出現(xiàn)灶性溶解損傷，可見大量初級溶酶體(圖3M)。血管及白細(xì)胞中可見零星的病毒粒子(圖3N、圖3O)。心肌細(xì)胞的線粒體損傷，出現(xiàn)大量髓樣體(圖3P)。還可見許多縱向嵴、嵴溶解和形狀畸形的線粒體(圖3Q)。

2.4 寄生蟲檢查和細(xì)菌分離

所檢患病褐龍斑均未觀察到寄生蟲。病魚的肝、腎、脾接種的TSA和TCBS培養(yǎng)基上僅長出零星的菌落，非細(xì)菌性疾病特征。經(jīng)16S rDNA測序鑒定，分別為哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、弧菌(Vibriospp.)、美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium damselae)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.)、交替單胞菌(Alteromonassp.)、亞硫酸鹽桿菌(Sulfitobactersp.)等。

2.5 病魚組織的PCR檢測

3尾病魚的脾、頭腎等組織，用引物1-F/1-R和4-F/4-R進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果均為強(qiáng)陽性，而健康褐龍斑未擴(kuò)增出任何條帶(圖4、圖5)。依據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1675-2014，可初步判定在褐龍斑各組織中發(fā)現(xiàn)的病毒為RSIV。

2.6 感染褐龍斑的虹彩病毒分類鑒定

從病魚脾組織中擴(kuò)增得到了病毒(命名為LZ170711株)DNA 片段，長度為 1581 bp。經(jīng) Blast 比對分析，該序列包含MCP基因完整的編碼區(qū)及其上游57個、下游162個核苷酸。其中，MCP基因編碼區(qū)全長為1362 bp，編碼453個氨基酸。

與GenBank數(shù)據(jù)庫中18種(株)虹彩病毒的相應(yīng)序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，LZ170711株與細(xì)胞腫大病毒屬虹彩病毒各毒株相似性在94%以上；而與蛙病毒屬、淋巴囊腫病毒屬、綠虹彩病毒屬和虹彩病毒屬虹彩病毒各毒株的相似性均在 55%以下。在細(xì)胞腫大病毒屬內(nèi)，與 RSIV各分離株相似性均超過 97%，與ISKNV和 TRBIV的各分離株相似性為 94.5%～ 95.1%。LZ170711 與 RSIV TGA14、RSIV 10GG、RSIV-8、RSIV-9的MCP基因序列完全一致，與RSIVEhime-1、RSIV 2HSB株有9個核苷酸的差異，相似性為97.9%。

圖3 病魚的超微病理變化(標(biāo)尺為 1 μm) Fig.3 Ultrastructural changes in the diseased fish (Bar=1 μm)

圖4 使用引物1-F/1-R檢測患病和健康褐龍斑Fig.4 PCR results of diseased and healthy fish using primer 1-F/1-R

圖5 使用引物4-F/4-R檢測患病和健康褐龍斑Fig.5 PCR results of diseased and healthy fish using primer 4-F/4-R

依據(jù)上述結(jié)果，用Mega 7軟件構(gòu)建了包含19種(株)虹彩病毒的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)。從圖6可以明顯看出，這些虹彩病毒分為5個病毒屬，LZ170711株位于細(xì)胞腫大病毒屬內(nèi)，且與RSIV各分離株的關(guān)系最近。

3 討論

魚類感染了腫大細(xì)胞虹彩病毒后，通常會體色變暗、游動異常、反應(yīng)遲鈍、嗜睡，且出現(xiàn)脾、腎組織腫大等癥狀(王慶等,2010; 何建國等,1998)。本研究發(fā)現(xiàn)，患病褐龍斑反應(yīng)遲鈍，脾、腎腫大，且脾質(zhì)地易碎。類似的病癥在患病尖吻鱸(Lates calcarifer)和褐籃子魚(Siganus fuscescens)中也有報道(文琳等,2015; 雷燕等,2014)。這些癥狀可用于腫大細(xì)胞虹彩病毒病的預(yù)警和初步診斷。

在組織病理方面，觀察到病魚各組織中存在細(xì)胞變性、凋亡等由病毒感染引起的典型病變。病魚脾和頭腎是腫大細(xì)胞虹彩病毒的靶器官，病理切片中可見大量嗜堿性、勻質(zhì)化、直徑為15～20 μm的腫大細(xì)胞，是該病的重要病理特征(Jancovichet al,2012)。通過超薄切片的電鏡觀察，在脾臟、頭腎的腫大細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量裝配完成尚未釋放的病毒粒子。令人感興趣的是，在電鏡超薄切片中，經(jīng)?？梢杂^察到腫大細(xì)胞的細(xì)胞膜具有大量的樹枝狀溝回結(jié)構(gòu)，其形成原因和生理學(xué)意義尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。此外，在病魚心臟和鰓的血管、白細(xì)胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了一定數(shù)量的病毒粒子，表明腫大細(xì)胞虹彩病毒可以通過血液循環(huán)在魚體各器官和組織內(nèi)擴(kuò)散(秦蕾等,2009)。尤其值得指出的是，一方面，本研究發(fā)現(xiàn)患病褐龍斑出現(xiàn)明顯的心肌萎縮、斷裂、間隙變大等病理特征，與此前報道的感染了虹彩病毒的條石鯛(Oplegnathus fasciatus)心臟病理特征一致(李華等,2011)。另一方面，在超薄切片中觀察到，病魚心肌細(xì)胞的線粒體病變明顯。大量的心肌細(xì)胞線粒體或出現(xiàn)縱向嵴，或退化成同心圓狀的髓樣體，意味著其呼吸功能的嚴(yán)重喪失。綜合上述病理特征，病魚心臟出現(xiàn)了嚴(yán)重的病理損傷，影響了魚體的血液循環(huán)，造成供氧不足，由此導(dǎo)致病魚表現(xiàn)出游泳無力、反應(yīng)遲鈍、嗜睡等表觀癥狀。

圖6 依據(jù)MCP基因構(gòu)建的19種(株)虹彩病毒系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of 19 iridovirus isolates (strains) based on the complete coding sequence of MCP gene

MCP是虹彩病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，其基因既高度保守，又有足夠的變異性，可以充分反映虹彩病毒的演化關(guān)系，是虹彩病毒分類鑒定的重要依據(jù)(Inouyeet al,1992; Chouet al,1998)。本研究測定并分析了感染褐龍斑的虹彩病毒的MCP基因，構(gòu)建了虹彩病毒系統(tǒng)發(fā)育樹，證實該病毒在分類地位上屬于虹彩病毒科細(xì)胞腫大病毒屬真鯛虹彩病毒類群。感染褐龍斑的該病毒與感染真鯛(Pagrus major)的RSIV-8、感染高體(Seriola dumerili)的 RSIV-9、感染斜帶石斑魚(E.coioides)的 RSIV 10GG、感染褐點石斑魚 (E.fuscoguttatus)的RSIV TGA14，其MCP基因編碼區(qū)全序列完全一致，可以認(rèn)為它們是同一種病毒。這表明RSIV的敏感宿主范圍很廣，其對多種海水魚類均具有極強(qiáng)的致病性。RSIV對褐龍斑的致病性此前未見有報道，有待深入研究。