Mdivi-1對帕金森病大鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用研究

郭 欣，朱子建，白 雅，張 云，劉學(xué)東

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫和肌強(qiáng)直等，其病理特征為黑質(zhì)紋狀體中多巴胺能神經(jīng)元受損，導(dǎo)致多巴胺(dopamine,DA)的含量顯著減少，引起相應(yīng)的病理改變[1]。目前普遍認(rèn)為PD的發(fā)病可能與遺傳、環(huán)境因素以及氧化應(yīng)激等相關(guān)[2]，但其具體機(jī)制仍遠(yuǎn)未明確。臨床上治療PD的藥物多為左旋多巴胺類，但該類藥物治療只能改善臨床癥狀和延緩病程進(jìn)展，不能阻止疾病向前發(fā)展。而且為達(dá)到治療效果需要不斷加大劑量，其產(chǎn)生的不良反應(yīng)如排尿困難等往往令患者難以忍受。因此，開發(fā)有效性高且不良反應(yīng)小的藥物已然成為該領(lǐng)域的研究熱點之一。

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)一種重要的細(xì)胞器，參與能量產(chǎn)生、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等諸多生命活動。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能異常與PD的發(fā)病密切相關(guān)，例如線粒體ATP產(chǎn)生異常及氧自由基的含量異常升高都參與PD的發(fā)生[3-4]。新近研究表明，線粒體處于分裂融合的動態(tài)平衡當(dāng)中，這種平衡對于維持線粒體功能及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有重要意義[5]。參與線粒體分裂的分子主要為動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)、線粒體分裂蛋白1(mitochondria fission protein 1,FIS1)、線粒體分裂因子(mitochondria fission factor,MFF),參與線粒體融合的分子主要為線粒體融合蛋白1(mitofusin 1，MFN1)、線粒體融合蛋白2(mitofusin 2，MFN2)和視神經(jīng)萎縮癥蛋白1(optic atrophy 1，OPA1)[5-6]。線粒體分裂異?？蓪?dǎo)致多種疾病的發(fā)生[7-9]。α-突觸共核蛋白(α-synuclein,α-syn)的氧化損傷被認(rèn)為是PD的重要發(fā)病機(jī)制之一[10-11]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)線粒體分裂融合異?？赡軐?dǎo)致α-syn的氧化損傷，從而參與PD的發(fā)生發(fā)展[12]。然而，關(guān)于線粒體分裂融合異常參與PD進(jìn)展的具體分子機(jī)制尚未研究。本研究從調(diào)控線粒體分裂融合的具體分子出發(fā)，探究其在PD中的作用及初步機(jī)制，并以此為靶點進(jìn)行干預(yù)，為開發(fā)治療PD的藥物進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 試劑 6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)(上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司，貨號RKY2061)；阿樸嗎啡(apomorphine，APO)(美國Sigma公司，貨號A4393)；美多巴(上海羅氏制藥有限公司，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H10930198)；線粒體分裂抑制劑1(mitochondrial division inhibitor 1，Mdivi-1)(美國Sigma公司，貨號M0199)；SYBR Green Master Mix試劑盒(日本TAKARA公司，貨號RR820A)；抗酪氨酸羥化酶抗體(英國Abcam公司，貨號ab112)；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋公司，貨號SP-9000-110ml)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(上海信裕生物科技有限公司，貨號XY-1560)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(美國Sigma公司，貨號MAK085)；還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒(美國Sigma公司，貨號CS0260)；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒(美國Sigma公司，貨號CGP1)；一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒(美國Biovision公司，貨號K252-200)；一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)檢測試劑盒(臺灣Abnova公司，貨號KA1345)。

1.2 儀器 實時定量PCR儀(美國伯樂公司，型號CFX 384)；腦立體定位儀(成都儀器廠，型號ST-5ND-C)；Panlab旋轉(zhuǎn)記錄儀(美國Harvard Apparatus公司，型號LE902)；轉(zhuǎn)棒疲勞儀(北京金洋萬達(dá)科技有限公司，型號JY-YLS-4C)；顯微鏡(日本奧林巴斯奧林巴斯公司，型號SZ51)；酶標(biāo)儀(美國伯樂公司，型號iMark)。

1.3 實驗動物分組和處理 將周齡6～8周、體質(zhì)量220～240 g的SPF級大鼠[許可證號：SCXK(陜)2018-001]隨機(jī)分為對照組(生理鹽水組)、模型組、Mdivi-1組和美多巴組，每組6只。Mdivi-1組給予Mdivi-1 50 mg/(kg·d)，美多巴組給予美多巴 50 mg/(kg·d)，模型組、對照組給予相同劑量的0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液(灌胃給藥)，給藥6周，1/d。

1.4 PD大鼠模型制備方法 將大鼠采用劑量為3.5 mL/kg水合氯醛麻醉后，利用腦定位儀固定大腦，消毒后手術(shù)切開充分暴露前囟。參照Paxinos等方法確定的腦圖譜，并按照Liu等[13]提供的方法對紋狀體三點進(jìn)行注射。每點用微量注射器緩慢注射6-OHDA(濃度為4 g/L，母液為含0.02%抗壞血酸的生理鹽水)1.0 μL，結(jié)束后針頭繼續(xù)放置5 min。待針頭緩慢拔出后縫合切口并預(yù)防感染。對照組采用上述方法注射相同劑量的生理鹽水。術(shù)后第5周,采用APO(0.5 mg/kg)皮下注射的方法誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)并記錄從開始到30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)。將向損傷側(cè)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)與向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)差值大于80 r/h的視為造模成功。

1.5 PD大鼠行為學(xué)觀察 在注射APO第3周和第6周后，分別觀察和記錄30 min內(nèi)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)。同時，采用旋轉(zhuǎn)棒實驗觀察大鼠術(shù)后第3和第6周的行為學(xué)變化。將大鼠置于旋轉(zhuǎn)棒上，旋轉(zhuǎn)棒啟動后立即計時。大鼠為穩(wěn)定在旋轉(zhuǎn)棒上需不斷轉(zhuǎn)動，隨著旋轉(zhuǎn)棒加速，大鼠最終從旋轉(zhuǎn)棒上掉下，結(jié)束計時。

1.6 ELISA法檢測氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo) 大鼠安樂死后，取出腦組織，將紋狀體和中腦黑質(zhì)區(qū)域剝離并稱重，放于生理鹽水中，制成終濃度為10%的勻漿液。在3 000 r/min條件下離心后小心吸取上清液為待測樣品。采用商品化的試劑盒，按照操作說明步驟分別檢測SOD、過氧化氫酶(catalase，CAT)、GSH-Px、NOS活性和MDA、GSH、NO含量。

1.7 實時定量PCR檢測線粒體分裂融合相關(guān)分子 取出各組腦組織的紋狀體和中腦后，按照組織RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實時定量PCR法檢測DRP1、FIS1、MFF、MFN1、MFN2和OPA1的mRNA表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。所用引物分別如下：DRP1,F:5′-CGTAGTGGGAACGCAGAG-3′和R:5′-ACAGGCACCTTGGTCATT-3′；FIS1,F:5′-AAAGGGAGCAAGGAGGAA-3′和R:5′-GGAGAACAGGGAAAGGACA3′;MFF，F(xiàn)：5′-ACATGCGCATTGGAGCAGTA-3和R：5′-GCCCCACTCACCAAATGAGA-3′；MFN1,F:5′-GTTTTTCCCTGGGCTGGTCT-3′和R:5′-CTCCTTGGCATGGGTGGTC-3′;MFN2,F:5′-GGGACCGCATCTTCTTTG-3′和R:5′-GTCTTGCCGCTCTTCACG-3′;OPA1，F(xiàn)：5′-TCATGGATCCGAAAGTGACA-3′和R：5′-ATCCTTCTGCAGCACCAACT-3′。

1.8 免疫組化檢測大鼠腦組織酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylasez，TH)表達(dá) 將大鼠處死后取出腦組織后制成冰凍切片。放入0.3% Triton X-100溶液中處理30 min。在3%的H2O2中封閉15 min，在山羊血清中封閉20 min，加入TH一抗(1∶200稀釋)溶液4 ℃孵育過夜。山羊抗鼠二抗孵育20 min，辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素孵育30 min。DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片。根據(jù)TH染色強(qiáng)度，分析并統(tǒng)計黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)和紋狀體區(qū)TH陽性纖維密度。

2 結(jié)果

2.1 PD大鼠模型制備成功 與對照組相比，模型組在術(shù)后第5周給予APO誘導(dǎo)后旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著增多(P<0.05)，對照組則無明顯旋轉(zhuǎn)。同時轉(zhuǎn)棒實驗顯示模型組在轉(zhuǎn)棒上的停留時間顯著短于對照組(P<0.05)，表明PD大鼠模型制備成功，表1、表2。

表1 APO誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)改變

表2 APO誘導(dǎo)大鼠轉(zhuǎn)棒停留時間改變

2.2 PD大鼠線粒體分裂融合相關(guān)分子表達(dá) 進(jìn)一步實時定量PCR結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中線粒體分裂關(guān)鍵調(diào)控因子DRP1的mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.001)，而其他線粒體分裂相關(guān)分子FIS1及MFF，融合相關(guān)分子MFN1、MFN2及OPA1的表達(dá)未見明顯變化(圖1)。

圖1 實時定量PCR檢測APO誘導(dǎo)大鼠線粒體分裂融合相關(guān)分子表達(dá)

2.3 DRP1抑制劑Mdivi-1對PD大鼠行為學(xué)影響與模型組比較，經(jīng)過Mdivi-1處理后第3周及6周，大鼠的旋轉(zhuǎn)圈均數(shù)顯著減少(P<0.05)，同時，經(jīng)美多巴處理后第3周及6周大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均較模型組顯著減少，但略高于Mdivi-1組(P<0.05，表3)。旋轉(zhuǎn)棒實驗結(jié)果顯示Mdivi-1組及美多巴組在給藥后第3周及6周停留在旋轉(zhuǎn)棒上的時間均長于模型組(P<0.05，表4)。

表3 Mdivi-1對APO誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)改變

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

表4 Mdivi-1對APO誘導(dǎo)大鼠轉(zhuǎn)棒停留時間改變

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

2.4 DRP1抑制劑Mdivi-1對PD大鼠腦組織內(nèi)TH表達(dá)影響 與對照組相比，模型組的大鼠腦組織左右兩側(cè)黑質(zhì)的TH陽性細(xì)胞數(shù)都顯著減少(P<0.05)，同時左右兩側(cè)紋狀體中TH陽性纖維密度與對照組比較也都顯著降低(P<0.05)。采用Mdivi-1及美多巴處理后第3周和6周，該組大鼠左右兩側(cè)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)均較模型組增多(P<0.05)，左右兩側(cè)紋狀體中TH陽性纖維密度均高于模型組(P<0.05)。表5、表6。

表5 Mdivi-1對大鼠黑質(zhì)TH表達(dá)影響

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

表6 Mdivi-1對大鼠紋狀體TH表達(dá)影響

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

2.5 DRP1抑制劑Mdivi-1對PD大鼠SOD，GSH-Px，CAT，NOS活性和MDA，GSH，NO含量的影響 模型組中損傷側(cè)的黑質(zhì)和紋狀體中SOD、GSH-Px和CAT活性顯著低于對照組；同時NOS的表達(dá)以及MDA、GSH、NO含量顯著上升(P<0.05)。Mdivi-1組和美多巴組在處理3周后，大鼠損傷側(cè)的黑質(zhì)和紋狀體中SOD、GSH-Px、GSH和CAT活性均顯著高于模型組(P<0.05)，而NOS的表達(dá)均顯著下降，同時MDA、NO含量均較模型組顯著下降(P<0.05)。表7、表8。

表7 Mdivi-1對大鼠黑質(zhì)中SOD、GSH-Px、CAT、NOS活性和MDA、GSH、NO含量的影響

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

表8 Mdivi-1對大鼠紋狀體中SOD、GSH-Px、CAT、NOS活性和MDA、GSH、NO含量影響

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

3 討論

目前研究認(rèn)為氧化應(yīng)激在PD發(fā)病過程中起著非常重要作用[14],而線粒體是產(chǎn)生氧自由基的主要細(xì)胞器，因此線粒體異常與PD發(fā)病的相關(guān)性研究已成為該領(lǐng)域的熱點[15-16]。線粒體分裂融合是調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)與功能的重要方式。因此，干預(yù)線粒體分裂融合有望成為治療PD的重要手段。但到目前為止，關(guān)于線粒體分裂融合異常與PD的發(fā)生進(jìn)展尚未進(jìn)行系統(tǒng)研究。此前，Bido等[17]利用病毒，使大鼠人類A53T-α-突觸共核蛋白(human A53T-α-synuclein,hA53T-α-syn)過表達(dá)并注射Mdivi-1，結(jié)果顯示，Mdivi-1可阻止DA的減少以及hA53T-α-syn所引起的神經(jīng)毒性作用，而且Mdivi-1有抑制α-syn氧化應(yīng)激的作用。而本研究利用6-OHDA注射單側(cè)紋狀體方法建立PD大鼠模型。對PD大鼠模型的行為學(xué)進(jìn)行觀察，并通過DA受體激動劑APO誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)實驗和轉(zhuǎn)棒實驗作為判斷PD大鼠模型是否構(gòu)建成功的標(biāo)準(zhǔn)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，PD大鼠模型組在APO誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯的旋轉(zhuǎn)，且該組大鼠在轉(zhuǎn)棒上停留時間顯著縮短。同時通過免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，PD大鼠黑質(zhì)中TH陽性細(xì)胞比例顯著下降，在紋狀體中TH陽性表達(dá)纖維的數(shù)量顯著減少，與PD的病理特征相符。這表明我們利用6-OHDA注射單側(cè)紋狀體的方法成功構(gòu)建PD大鼠模型，在此模型基礎(chǔ)上可進(jìn)行下一步研究。

在PD大鼠模型組，利用實時定量PCR檢測線粒體分裂融合相關(guān)分子的表達(dá)變化。線粒體分裂關(guān)鍵調(diào)控分子DRP1在PD大鼠腦組織中的表達(dá)顯著高于正常對照組。本研究初步提示線粒體分裂關(guān)鍵調(diào)控分子異常增多可能在PD發(fā)生進(jìn)展中扮演重要角色。本研究以DRP1為切入點，探究干預(yù)DRP1后能否改善PD大鼠多巴胺能神經(jīng)元受損狀況。

Mdivi-1是一種小分子化合物，是DRP1的有效抑制劑。本研究根據(jù)上述結(jié)果，采用Mdivi-1抑制DRP1后，觀察其對6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠模型的干預(yù)效果，并將實驗結(jié)果與已知PD治療藥物美多巴進(jìn)行比對，初步探討其可能的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，Mdivi-1組與美多巴組的實驗結(jié)果相似，都可顯著改善PD大鼠的行為學(xué)特征。例如PD大鼠模型組在Mdivi-1處理后，可顯著減輕APO誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，同時大大延長PD大鼠在旋轉(zhuǎn)棒上停留的時間。此外，經(jīng)過Mdivi-1干預(yù)后，PD大鼠腦組織黑質(zhì)中TH陽性細(xì)胞數(shù)目和紋狀體中TH陽性染色纖維密度較未干預(yù)PD組顯著增加。本研究表明Mdivi-1可對6-OHDA注射法誘導(dǎo)的PD大鼠多巴胺神經(jīng)元有著重要的保護(hù)作用。

線粒體是氧化應(yīng)激的重要場所[19]，氧化應(yīng)激已是公認(rèn)的PD重要病因之一[20]。本研究從氧化應(yīng)激角度初步探索Mdivi-1顯著改善PD大鼠受損的多巴胺能神經(jīng)元的機(jī)制。在6-OHDA引發(fā)的PD大鼠黑質(zhì)及紋狀體中，抗氧化酶系統(tǒng)活性如SOD、GSH-Px、CAT顯著降低，同時抗氧化物質(zhì)GSH含量降低，導(dǎo)致氧自由基如MDA和NO含量升高，且增強(qiáng)NOS的表達(dá)水平，表明機(jī)體抗氧化系統(tǒng)異常，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。而對Mdivi-1處理后的PD大鼠黑質(zhì)和紋狀體中的抗氧化酶系統(tǒng)活性以及相關(guān)物質(zhì)含量檢測后發(fā)現(xiàn)，SOD、GSH-Px、CAT和GSH活力顯著提高，MDA和NO含量明顯降低，與美多巴實驗結(jié)果相近，同時NOS的表達(dá)降低，與美多巴組實驗結(jié)果相近。本研究表明Mdivi-1可顯著提高6-OHDA誘發(fā)的PD大鼠抗氧化能力。

綜上，DRP1抑制劑Mdivi-1可顯著修復(fù)PD大鼠受損的多巴胺能神經(jīng)元，改善PD癥狀，且提高機(jī)體的抗氧化能力。這表明Mdivi-1具有保護(hù)6-OHDA誘發(fā)的PD大鼠神經(jīng)元功能，且這種功能可能與增強(qiáng)其抗氧化能力有關(guān)。進(jìn)一步研究Mdivi-1修復(fù)多巴胺能神經(jīng)元和對抗氧化應(yīng)激的機(jī)制，對探索治療PD的新方法具有重要意義。