熱研4號(hào)王草對(duì)不同有機(jī)磷活化利用能力的評(píng)價(jià)

黃睿 趙興坤 虞道耿 劉攀道 劉國(guó)道 王文強(qiáng)

摘? 要? 本研究以熱研4號(hào)王草（Pennisetum purpureum × P. glaucum cv. Reyan No. 4）為材料，通過(guò)砂培試驗(yàn)評(píng)價(jià)其對(duì)4種有機(jī)磷的利用能力。結(jié)果表明，王草對(duì)三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）和6-磷酸葡萄糖（G6P）均具有利用能力，且對(duì)磷酸單酯類(lèi)（AMP和G6P）的利用能力更強(qiáng)。酸性磷酸酶（ACP）活性分析表明，有機(jī)磷處理使王草根系內(nèi)源與分泌的總ACP活性顯著增加0.9倍以上，但王草對(duì)有機(jī)磷的利用能力與根系總ACP活性無(wú)相關(guān)性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，王草根系分泌特異ACP活性與不同有機(jī)磷處理的植株干重顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2=0.861。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)王草對(duì)不同類(lèi)型有機(jī)磷的利用能力主要由其根系分泌的特異ACP活性決定。研究結(jié)果可為選育磷高效熱帶牧草品種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 王草;有機(jī)磷;酸性磷酸酶;酸性土壤;低磷脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)? S543? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

Abstract? In this study， Pennisetum purpureum × P. glaucum cv. Reyan No. 4 （King grass） was used to investigate the capacity to utilize four types of organic phosphorus （P） in a sand cultivation experiment. The results showed that King grass had different capabilities to mobilize adenosine triphosphate （ATP）， adenosine diphosphate （ADP）， adenosine monophosphate （AMP）， glucose-6-phosphate （G6P）， and more capable of utilizing phosphate monoester （AMP or G6P） as the sole P source. Analysis of acid phosphatase （ACP） activity showed that total internal-ACP and secreted-ACP activities of roots significantly increased by more than 0.9-fold in organic P treatments. However， correlation between root total ACP activity and capacity to utilize organic P in King grass was not significant. Furthermore， significant positive correlation was found between root specific secreted-ACP activity and plant dry weight in different organic P treatments， with the observed R2=0.861. Taken together， our results suggest that root specific secreted-ACP activity control organic P utilization in King grass. Our results would provide a theoretical basis for selecting and breeding tropical grass varieties with high P efficiency.

Keywords? King grass; organic phosphorus; acid phosphatase; acid soil; phosphorus deficiency

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.003

全世界范圍內(nèi)有超過(guò)50%的可耕作土壤為pH低于5.5的酸性土壤[1]。在我國(guó)南方各省區(qū)，有將近2千萬(wàn)hm2的酸性土壤，約占全國(guó)耕地面積的21%[2]。磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的大量營(yíng)養(yǎng)元素[3]。植物對(duì)土壤中磷素的吸收主要以無(wú)機(jī)可溶性磷（正磷酸根，Pi）形式，但在酸性土壤中，Pi易被鋁和鐵等離子固定，形成不能被植物直接吸收和利用的無(wú)機(jī)難容性磷[3]。因此，低磷脅迫已成為酸性土壤限制作物生產(chǎn)的主要障礙因子之一[4]。

土壤中雖然Pi的濃度低，但儲(chǔ)藏著豐富的有機(jī)磷[5]。有機(jī)磷一般占土壤全磷含量的30%～65%，包括磷酸酯、多聚磷酸酯、微生物量磷等類(lèi)型[5]。其中，磷酸酯在土壤有機(jī)磷中占比最大，如磷酸糖類(lèi)、單核苷酸、植酸磷等[6]。但是，有機(jī)磷難于被植物直接利用，只有被酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）降解后釋放出的Pi才能被根系吸收[7]。已有的研究表明，多數(shù)作物在缺磷條件下的根系A(chǔ)CP活性顯著增加，如：水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）、油菜（Brassica napus）、菜豆（Phaseolus vulgaris）等[8]。通過(guò)提高ACP活性促進(jìn)對(duì)有機(jī)磷的活化利用，是植物中普遍存在的適應(yīng)低磷脅迫機(jī)制[9]。

熱研4號(hào)王草（Pennisetum purpureum×P. glaucum cv. Reyan No. 4）是一種由象草和美洲狼尾草雜交獲得的禾本科狼尾草屬植物[10]。王草的光合效率高，株型大（株高1.5～4.5 m），年鮮草產(chǎn)量一般可達(dá)300 t/hm2以上，其營(yíng)養(yǎng)成分在熱帶禾本科牧草中處于較高水平[11]。目前，王草在我國(guó)南方熱帶和亞熱帶地區(qū)被大量種植，是一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的熱帶牧草與飼料作物[12]。此外，王草可作為培養(yǎng)基質(zhì)用于栽培平菇、靈芝、猴頭菇、滑菇、草菇等食用菌[12]。雖然王草的產(chǎn)量高，但其對(duì)肥料的需求巨大[13]。因此，改良王草的養(yǎng)分利用效率對(duì)熱帶牧草的“減肥增效”具有重要意義。本研究將評(píng)價(jià)王草對(duì)土壤潛在磷庫(kù)—有機(jī)磷的利用能力，并分析根系A(chǔ)CP活性與有機(jī)磷的利用的相關(guān)性，以期為培育磷高效的王草品種提供理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 植物材料和培養(yǎng)條件

以熱研4號(hào)王草為試驗(yàn)材料，于2017年8—11月在海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院基地網(wǎng)室進(jìn)行材料培養(yǎng)。參照Kong等[14]的砂培試驗(yàn)方法，對(duì)王草進(jìn)行不同的磷源處理。選取長(zhǎng)度約為15 cm的王草種莖，置于盛有砂子的盆中，蓋上2 cm厚的砂子。待種莖發(fā)芽后，選取出苗整齊的種苗，低磷（?P）和正常供磷（+P）處理分別以含10 μmol/L KH2PO4和600 μmol/L KH2PO4的Hoag land營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行澆灌，每2 d澆營(yíng)養(yǎng)液一次，每次澆透。在處理后的6、12、18、24 d收獲樣品。有機(jī)磷處理以含不同有機(jī)磷源的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行澆灌，包括三磷酸腺苷（+ATP，200 μmol/L ATP）;二磷酸腺苷（+ADP，300 μmol/L ADP）、一磷酸腺苷（+AMP，600 μmol/L AMP）和6-磷酸葡萄糖（+G6P，600 μmol/L G6P）。處理18 d后收獲樣品。

1.2? 方法

1.2.1? 植株干重和全磷含測(cè)定? 收獲的王草樣品在75 ℃烘干至恒重后測(cè)定植株干重，每處理測(cè)4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。稱取約0.07 g研磨混勻后的干樣品，用乙醇/濃硫酸（V/V=95/5）混合液浸濕后，置于馬福爐中600 ℃灰化10 h?；一蟮臉悠酚? mL HCl（100 mmol/L）溶解后即為磷提取液。全磷含量的測(cè)定參照Murphy等[15]的方法，取適量體積的樣品磷提取液，用雙蒸水定容到1.8 mL，再加入0.2 mL鉬銻抗顯色液，混勻后靜置30 min，測(cè)OD700的吸光值。

1.2.2? 根系內(nèi)源的ACP活性測(cè)定? 稱取0.1～0.2 g的根系新鮮樣品，用1.2 mL Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）研磨成勻漿后離心（14 000 r/min，4 ℃，30 min），收集上清液即為內(nèi)源蛋白提取液。蛋白濃度參照Bradford[16]的方法測(cè)定。內(nèi)源總ACP活性參照Liang等[17]的方法，以硝基苯磷酸環(huán)己胺（ρ-NPP）為磷酸酶底物，用醋酸-醋酸鈉緩沖液（45 mmol/L，pH 5.0）配制成含1 mmol/L ρ-NPP的底物反應(yīng)液。取適量體積的內(nèi)源蛋白提取液與1.8 mL底物反應(yīng)液混合并用雙蒸水定容至2 mL。37 ℃反應(yīng)15 min，用0.2 mL NaOH溶液（2 mol/L）終止反應(yīng)，測(cè)OD405的吸光度值。內(nèi)源特異ACP活性的測(cè)定參照George等[18]的方法，分別配制ATP、ADP、AMP和G6P的底物反應(yīng)液（濃度為2 mmol/L），用于測(cè)定ATP磷酸酶（ATPase）、ADP磷酸酶（ADPase）、AMP磷酸酶（AMPase）和G6P磷酸酶（G6Pase）的活性。取適量體積的內(nèi)源蛋白提取液加到0.8 mL底物反應(yīng)液中，用雙蒸水定容至0.9 mL。混勻后于37 ℃反應(yīng)60 min，用0.3 mL的三氯乙酸溶液（10%）終止反應(yīng)。參照Irving和McLaughlin[19]的孔雀石綠測(cè)磷方法，通過(guò)OD650的吸光度值計(jì)算ACP催化底物釋放的Pi。以不含底物的反應(yīng)液作為樣品對(duì)照，計(jì)算樣品本身的Pi濃度。酶活力單位1 U表示1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol底物的酶量。內(nèi)源ACP活性用單位蛋白（mg）的酶活力單位（U）表示。

1.2.3? 根系分泌的ACP活性測(cè)定? 待測(cè)的植株活體根系用CaCl2溶液（0.5 mmol/L）沖洗3次，根據(jù)Richardson等[20]的方法測(cè)定根系分泌的ACP活性?？侫CP活性以ρ-NPP為底物，特異ACP以相應(yīng)的有機(jī)磷為底物。沖洗的根系浸沒(méi)于200 mL的底物反應(yīng)液（1 mmol/L），25 ℃避光反應(yīng)15 min后加入20 mL反應(yīng)終止液。取出根系，將反應(yīng)液在室溫下12 000 r/min，離心2 min?？侫CP活性取上清液測(cè)定OD405，特異ACP活性測(cè)定OD650。分泌ACP活性用單位根鮮重（g）的酶活力單位（U）表示。

1.3? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

通過(guò)SPSS18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)可視化作圖采用Microsoft Excel 2013軟件。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 低磷脅迫對(duì)王草植株干重和根系內(nèi)源總ACP活性的動(dòng)態(tài)影響

低磷脅迫（?P）處理6 d和12 d對(duì)王草的生長(zhǎng)無(wú)顯著抑制作用，但從第18天開(kāi)始，?P處理顯著抑制了王草生長(zhǎng)，?P處理18 d和24 d的王草植株干重分別只有正常供磷（+P）處理的33%和38%，差異顯著。與植株干重不同，王草的根系內(nèi)源總ACP活性從?P與+P處理第12天開(kāi)始就出現(xiàn)顯著的處理間差異，?P處理12、18、24 d的根系內(nèi)源總ACP活性比+P處理高60%～153%。以上結(jié)果表明王草的ACP活性雖然在?P處理12 d就開(kāi)始響應(yīng)低磷脅迫，但植株干重在?P處理18 d后才顯著降低。

2.2? 不同有機(jī)磷處理對(duì)王草植株干重和全磷含量的影響

根據(jù)2.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取處理時(shí)長(zhǎng)18 d對(duì)王草進(jìn)行四種不同的有機(jī)磷（+ATP，+ADP，+AMP，+G6P）處理。4種有機(jī)磷處理使王草的植株干重和全磷含量分別比?P處理提高1.1～2.2倍和3.7～8.8倍，分別達(dá)到+P處理下植株干重和全磷含量的66%～98%和33%～68%，表明王草對(duì)這4種有機(jī)磷均具有利用能力。但是，王草對(duì)不同有機(jī)磷的利用能力存在差異。在+G6P處理下的植株干重和全磷含量顯著高于+ATP處理與+ADP處理，表明王草對(duì)G6P具有更強(qiáng)的利用能力。王草對(duì)4種不同有機(jī)磷的利用能力強(qiáng)弱為：G6P≥AMP≥ADP≥AMP。

2.3? 不同有機(jī)磷處理對(duì)王草根系總ACP活性的影響

?P處理使根系內(nèi)源和分泌的總ACP活性分別比+P處理提高1.6和4.5倍，差異顯著（P<0.05）。在4種有機(jī)磷（+ATP，+ADP，+AMP，+G6P）處理下，雖然根系內(nèi)源和分泌的總ACP活性與?P處理間無(wú)顯著差異，但比+P處理增加0.9～1.5倍與2.3～2.9倍，差異顯著（P<0.05）。王草對(duì)4種有機(jī)磷的利用能力與根系總ACP活性的相關(guān)性分析，王草在不同有機(jī)磷處理下的植株干重與根系內(nèi)源和分泌的ACP活性均無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。以上結(jié)果表明，由于有機(jī)磷處理?xiàng)l件下的磷有效性低（Pi含量低），王草的根系內(nèi)源和分泌的總ACP活性顯著增加，但是根系總ACP活性不能解釋王草對(duì)不同有機(jī)磷利用能力的差異。

2.4? 不同有機(jī)磷處理對(duì)王草根系特異ACP活性的影響

為解析王草對(duì)不同有機(jī)磷利用能力的差異，本研究進(jìn)一步分析了相應(yīng)有機(jī)磷處理下的特異ACP活性，即測(cè)定：+ATP處理的ATPase活性、+ADP處理的ADPase活性、+AMP處理的AMPase活性和+G6P處理的G6Pase活性。+ATP處理下的根系內(nèi)源的特異ACP活性顯著高于其他三種有機(jī)磷處理（+ADP，+AMP，+G6P）。相關(guān)性分析表明，王草在不同有機(jī)磷處理下的植株干重與根系內(nèi)源的特異ACP活性無(wú)顯著相關(guān)性。與內(nèi)源的特異ACP活性不同，在+AMP和+G6P處理下，根系分泌的特異ACP活性顯著高于+ATP和+ADP處理。并且，在不同有機(jī)磷處理下，王草的植株干重與根系分泌的特異ACP活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系（R2=0.861， P<0.01）。以上結(jié)果表明，王草根系分泌的特異ACP活性高低，決定了其對(duì)相應(yīng)有機(jī)磷利用能力的強(qiáng)弱。

3? 討論

土壤中的有機(jī)磷根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)差異分為磷酸酯、膦酸鹽、多聚磷酸酯、微生物量磷等[21]。其中，磷酸酯又分為磷酸單酯類(lèi)和磷酸二酯類(lèi)[21]。磷酸單酯通過(guò)羥基酯化與C鏈相連，形成磷酸酯（C-O-P）形式，是土壤中含量最為豐富的有機(jī)磷類(lèi)型，如植酸磷、磷酸糖類(lèi)和單核苷酸等屬于此類(lèi)[22]。磷酸二酯以C-O-P-O-C形式橋接，如磷脂類(lèi)和核酸等，耕作土壤中磷酸二酯在有機(jī)磷含量中占比低于10%[22]。膦酸鹽含碳磷鍵（C-P），主要來(lái)源于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的含磷農(nóng)藥殘留物，如草甘膦[23]。多聚磷酸酯具有磷酸單酯和膦酸鹽的符合結(jié)構(gòu)，如ATP和ADP等[24]。微生物量磷是土壤中所有活體微生物細(xì)胞內(nèi)所含的磷，主要以核酸形式存在，約占土壤全磷的0.4%～7.5%[25]。雖然土壤中的有機(jī)磷含量豐富，但需要被ACP催化降解后才能被植物利用。研究植物根系A(chǔ)CP活化利用有機(jī)磷的機(jī)理，對(duì)選育磷高效的作物與牧草品種具有重要意義[26]。

植物根系的ACP根據(jù)其亞細(xì)胞定位可被分為兩大類(lèi)，第1類(lèi)為分泌型ACP，包括細(xì)胞壁、質(zhì)外體或根系分泌到土壤中的ACP，主要參與根際環(huán)境和胞外空間的有機(jī)磷活化利用;第2類(lèi)為內(nèi)源ACP，一般指定位于胞內(nèi)空間的ACP，如細(xì)胞質(zhì)和液泡中的ACP，主要參與細(xì)胞中貯存有機(jī)磷的再活化利用[27]。已有研究表明，植物對(duì)外源有機(jī)磷的活化利用主要與根系分泌ACP相關(guān)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在4種有機(jī)磷處理下，根系內(nèi)源與分泌的總ACP活性均顯著增加，但分泌ACP活性的增幅更大，這可能是由于在缺乏Pi條件下，王草通過(guò)調(diào)控根系分泌大量ACP來(lái)活化外源有機(jī)磷。

ACP根據(jù)底物特異性可被分為：植酸酶（phytase）、磷酸葡萄糖磷酸酶（glucose phosphate phosphatase）、腺嘌呤核苷三磷酸磷酸酶（ATP phosphatase）、焦磷酸磷酸酶（pyrophosphate phosphatase）等，不同類(lèi)型的ACP對(duì)有機(jī)磷的催化活性存在差異[7， 29]。已有的研究表明，小麥、三葉草（Trifolium subterraneum）和苜蓿（Medicago sativa）由于根系分泌的ACP不具有植酸酶活性，導(dǎo)致它們?nèi)狈?duì)植酸磷的利用能力[30]。本研究的結(jié)果表明，王草能活化利用所選用的4種有機(jī)磷，且對(duì)磷酸單酯類(lèi)有機(jī)磷（G6P和AMP）的利用能力強(qiáng)于對(duì)多聚磷酸酯類(lèi)有機(jī)磷（ATP和ADP）的利用能力。相關(guān)性分析表明，王草對(duì)4種有機(jī)磷的活化利用能力與根系內(nèi)源總ACP活性、分泌總ACP活性和內(nèi)源特異ACP活性均無(wú)顯著相關(guān)性，而與根系分泌特異ACP活性顯著正相關(guān)。因此，王草對(duì)AMP和G6P的利用能力較強(qiáng)主要是由于根系分泌的特異ATPase和G6Pase活性較高導(dǎo)致的。本研究對(duì)狼尾草屬植物的磷高效種質(zhì)篩選具有參考價(jià)值，分析該屬植物對(duì)不同類(lèi)型外源有機(jī)磷的利用能力，可以用根系分泌特異ACP活性作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。

綜上所述，本研究證明了低磷脅迫誘導(dǎo)王草根系內(nèi)源與分泌的ACP活性增加。王草對(duì)磷酸單酯類(lèi)的利用能力強(qiáng)于多聚磷酸酯，并初步解析了王草對(duì)不同有機(jī)磷的活化利用能力強(qiáng)弱主要由根系分泌的特異ACP活性決定。研究結(jié)果將為后續(xù)研究選育磷高效的熱帶牧草品種提供理論依據(jù)。

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