不同亞型的大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤的KRAS、APC、p53表達(dá)

鐘選芳 黃文峰 劉宇輝

[摘要]目的 比較不同亞型的大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤（LST）、≥10 mm隆起型腺瘤、進(jìn)展期大腸癌的KRAS、APC、p53的基因表達(dá)情況，探討不同亞型LST的分子發(fā)生途徑。方法 應(yīng)用高分辨率溶解曲線法（HRM）分別檢測(cè)2016年1月～2018年7月我院收治的38例顆粒型LST（LST-G）和13例非顆粒型LST（LST-NG）以及60例隆起型腺瘤、48例進(jìn)展期大腸癌的KRAS、APC、p53的基因表達(dá)情況，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較四組病變的基因表達(dá)差異。結(jié)果 LST-G，LST-NG，隆起型腺瘤、進(jìn)展期大腸癌的KRAS、APC、p53突變率分別為52.6%、7.7%、46.7%和60.4%，15.8%、53.8%、20.0%和58.3%，7.9%、46.2%、11.7%和66.7%。LST-NG組KRAS突變率均低于LST-G組、隆起型腺瘤組和進(jìn)展期大腸癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而LST-G組和隆起型腺瘤組KRAS突變率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；LST-NG組APC和p53突變率高于LST-G組和隆起型腺瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而LST-G組和隆起型腺瘤組APC和p53突變率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），LST-NG組的APC和p53突變率低于進(jìn)展期大腸癌組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 LST-G和LST-NG的基因表達(dá)不同，2種不同亞型的LST可能存在不同的分子發(fā)生途徑。

[關(guān)鍵詞]大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤；亞型；高分辨率溶解曲線法；分子發(fā)生機(jī)制

[中圖分類號(hào)] R735.34 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）5（b）-0060-03

Expression of KRAS， APC and p53 in different subtypes of laterally spreading tumors

ZHONG Xuan-fang HUANG Wen-feng LIU Yu-hui

Department of Gastroenterology， Huizhou First People′s Hospital， Guangdong Province， Huizhou 516001， China.

[Abstract] Objective To compare the gene expression of KRAS， APC and p53 in different subtypes of colorectal lateral developmental tumors （LST）， polypoid colorectal adenomas （≥10 mm） and advanced colorectal cancer， and to investigate the molecular pathogenesis of the different subtypes of colorectal lateral developmental tumors. Methods The gene expression of KRAS， APC and p53 in our hospital from January 2016 to July 2018， 38 cases of granular categories （LST-G）， 13 cases of nongranular categories（LST-NG）， 60 cases of polypoid colorectal adenomas and 48 cases of advanced colorectal cancer were detected by High Resolution Melting（HRM）. Results The mutation rate of KRAS， APC and p53 in LST-G group， LST-NG group， polypoid adenoma group and colorectal cancer group were 52.6%， 7.7%， 46.7%and 60.4%， 15.8%； 53.8%， 20.0% and 58.3%， 7.9%， 46.2%， 11.7%， and 6.7% respectively. The KRAS mutation rate of LST-NG group were significantly lower than LST-G group， polypoid adenomas group and advanced colorectal cancer group respectively（P<0.05）. But there was no significant difference between LST-G group and polypoid adenomas group （P>0.05）. The APC and p53 mutation rate of LST-NG group were significantly higher than LST-G and polypoid adenomas group （P<0.05）， whereas the APC and p53 mutation rate were no significant difference between LST-G group and polypoid adenomas group （P>0.05）， the APC and p53 mutation rate in LST-NG group were lower than the advanced colorectal cancer group， but there were no statistically significant difference （P>0.05）. Conclusion The differences of gene expression between LST-G and LST-NG may remind the different molecular pathways.

[Key words] Laterally spreading tumor； Subtype； High Resolution Melting； Molecular pathogenesis

大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤（LST）是一類起源于大腸黏膜的平坦隆起型病變，因與大腸癌關(guān)系密切受到重視[1]。LST形態(tài)多樣，內(nèi)鏡下分為多種不同亞型，與隆起型息肉比具有獨(dú)特的病變形態(tài)、生長(zhǎng)方式和生物學(xué)行為[2-3]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)LST的研究主要集中在與隆起型腫瘤的比較上，很少關(guān)于不同亞型LST間的基因表達(dá)情況的研究[4-5]。本研究通過(guò)比較不同亞型的LST、隆起型腺瘤、進(jìn)展期大腸癌的KRAS、APC、p53的基因表達(dá)情況，初步探討不同亞型的LST的分子發(fā)生途徑與隆起型腺瘤的差異，現(xiàn)報(bào)道如下

1資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2016年1月～2018年7月經(jīng)內(nèi)鏡或外科手術(shù)切除的所有LST標(biāo)本51例，根據(jù)內(nèi)鏡下形態(tài)是否呈顆粒集簇樣改變分為顆粒型（LST-G）38例和非顆粒型（LST-NG）13例；同時(shí)收取同期經(jīng)內(nèi)鏡切除的直徑≥10 mm隆起型腺瘤標(biāo)本60例和經(jīng)手術(shù)切除的進(jìn)展期大腸腺癌標(biāo)本48例，根據(jù)疾病的類型分為4組。所有患者術(shù)前均未接受任何放療或化療，并排除炎癥性腸病、家族性腺瘤性息肉病和遺傳性非息肉病性大腸癌、非原發(fā)癌灶患者。所有標(biāo)本均有完整的臨床和病理資料（表1）。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者在檢查及治療前均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑和儀器 Genomic DNA Extraction Kit購(gòu)自日本Takara公司，HRM分析試劑盒購(gòu)自北京天根公司，HRM檢測(cè)采用全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)Light Cycler 480 System。

1.2.2 DNA的提取 按Takara說(shuō)明書提供的操作流程提取DNA，并保存在-20℃冰箱中。提取DNA的濃度和純度測(cè)定均用Nano Drop ND.1000分光光度計(jì)檢測(cè)，DNA質(zhì)量經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 PCR-HRM分析 根據(jù)KAS、APC、p53基因序列使用Primer Premier 5.00軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增和HRM在Light Cycler 480 System一個(gè)反應(yīng)中完成，所有反應(yīng)均可重復(fù)進(jìn)行。使用Gene Scanning Software分析HRM的數(shù)據(jù)。同時(shí)從組織DNA標(biāo)本中擴(kuò)增出KAS、APC、p53基因片段，由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行直接測(cè)序，檢測(cè)KAS、APC、p53基因突變發(fā)生的具體位點(diǎn)和堿基變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法，各組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1四組基因表達(dá)情況的比較

LST-NG組的KRAS突變率均低于LST-G組和隆起型腺瘤組、進(jìn)展期大腸癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），LST-G組和隆起型腺瘤組KRAS突變率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；LST-NG組的APC和p53突變率高于LST-G組和隆起型腺瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），LST-G組和隆起型腺瘤組APC和p53突變率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），LST-NG組的APC和p53突變率低于進(jìn)展期大腸癌組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

2.2基因測(cè)序結(jié)果

用HRM法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)突變的KRAS、APC、p53基因與基因測(cè)序結(jié)果一致率為100%，34號(hào)標(biāo)本KRAS-3基因測(cè)序結(jié)果，箭頭所示為突變位點(diǎn)（圖1，見封四）。

3討論

約有2/3的散發(fā)性大腸癌的發(fā)生遵循傳統(tǒng)腺瘤途徑，通常表現(xiàn)為隆起型息肉樣外觀，KRAS、APC和p53被認(rèn)為是大腸癌發(fā)生發(fā)展的重要癌基因和抑癌基因[6]。另外平坦型腫瘤被認(rèn)為與傳統(tǒng)隆起型腺瘤的癌發(fā)生途徑不同，緣于它們有不同的基因和遺傳學(xué)表型突變[7]。LST是一類特殊類型的平坦型腫瘤，內(nèi)鏡下形態(tài)多樣，亞型眾多，主要分為顆粒型和非顆粒型，其中顆粒型又再分為顆粒均一型和結(jié)節(jié)混合型，而非顆粒型分為平坦型和假凹陷型[8]。最近的研究提示LST可能存在不同的分子癌變發(fā)生途徑，各亞型遵循的癌變途徑可能不同，前期的研究也提示不同形態(tài)的LST可能存在不同的基因調(diào)控機(jī)制[9-10]。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上采用HRM法進(jìn)一步檢測(cè)不同亞型的LST的癌基因和抑癌基因表達(dá)情況，結(jié)果提示KRAS突變率在LST-G和隆起型腺瘤比LST-NG明顯增高，提示KRAS信號(hào)途徑激活可能參與LST-G的發(fā)生發(fā)展，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。文獻(xiàn)報(bào)道KRAS突變率在LST-G和LST-NG分別是70%（30/43）和26%（13/50），提示KRAS參與的RTK/RAS突變信號(hào)途徑在LST-G比LST-NG更常出現(xiàn)[11]。KRAS基因?yàn)榘┗?，主要參與大腸癌發(fā)生的早期，Sugimoto等[12]檢測(cè)了50例隆起型腫瘤，35例LST-G和19例LST-NG的KRAS突變率分別為30.0%，54.3%，21.1%，進(jìn)一步通過(guò)多因素分析表明不同形態(tài)的LST與KRAS突變率顯著相關(guān)，提示KRAS參與的信號(hào)激活途徑可能對(duì)LST-G發(fā)生發(fā)展起更重要的作用，間接提示LST-NG的發(fā)生發(fā)展可能存在其他不同的途徑。

APC基因?yàn)橐职┗颍饕趙nt信號(hào)通路中起關(guān)鍵的抑制作用，是大腸癌發(fā)生的早期事件。Shi等[13]報(bào)道Wnt/β-catenin/c-myc途徑激活與LST的發(fā)生和惡變密切相關(guān)，Sugimoto等[12]報(bào)道LST-NG的wnt-beta連環(huán)蛋白信號(hào)途徑中APC基因突變?yōu)橹饕蛩?，本研究結(jié)果提示APC基因突變?cè)贚ST-NG比LST-G和隆起型腺瘤高，提示APC基因參與的wnt-beta連環(huán)蛋白信號(hào)途徑可能與LST-NG發(fā)生發(fā)展有更密切的聯(lián)系，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

p53基因在進(jìn)展性腺瘤發(fā)展成腺癌的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，主要發(fā)生在大腸癌的晚期階段。本研究結(jié)果提示，LST-NG p53突變率較LST-G高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。Nagai等[14]報(bào)道p53在LST-G的陽(yáng)性率比LST-NG低，提示LST-NG與LST-G不同，前者更有類似于癌的表型特征。Sakai等[15]通過(guò)多因素分析表明p53突變?yōu)長(zhǎng)ST惡變獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示LST-NG可能較LST-G的惡性潛能高，LST-NG更易發(fā)生黏膜下浸潤(rùn)。

綜上所述，目前大腸癌發(fā)生途徑仍不明確，LST形態(tài)多樣，不同亞型可能遵循不同的分子發(fā)生途徑，或者說(shuō)形態(tài)上相似的大腸腫瘤或許仍然存在兩種或更多種不同的分子發(fā)生機(jī)制，值得進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]張艷飛，丁士剛.大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤的診斷及內(nèi)鏡治療進(jìn)展[J].中國(guó)微創(chuàng)外科雜志，2017，17（12）.1117-11125.

[2]Ni HB，Wang FY，Xu J，et al.Screening and identification of a tumor specific methylation phenotype in the colorectal laterallyspreading tumor[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017， 21（11）：2611-2616.

[3]Wu J，Huo JR，Wang D，et al.Expression of Wnt and integrin pathways in colorectal laterally spreading tumors and their correlation with endoscopic subtypes[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2017，37（9）：1234-1241.

[4]蘭世遷，廖仙紅，謝如飛.結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤行內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)治療的臨床效果觀察[J].實(shí)用醫(yī)技雜志，2018， 25（1）：71-72.

[5]Wang J，Wang X，Gong W，et al.Increased expression of beta-catenin， phosphorylated glycogen synthase kinase 3beta，cyclin D1，and c-myc in laterallyspreadingcolorectal tumors[J].J Histochem Cytochem，2009，57（4）：363-371.

[6]朱良亮，于恩達(dá).大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤分子生物學(xué)特征的研究進(jìn)展[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2018，24（4）：573-576.

[7]Takahashi T，Nosho K，Yamamoto H，et al.Flat-type colorectal advanced adenomas （laterally spreading tumors） have different genetic and epigenetic alterations from protruded-type advanced adenomas[J].Mod Pathol，2007，20（1）：139-147.

[8]Myung DS，Kweon SS，Lee J，et al.Clinicopathological features of laterally spreading colorectal tumors and their association with advanced histology and invasiveness： an experience from Honam province of South Korea：a Honam Association for the Study of Intestinal Diseases （HASID）[J].PLoS One，2017，12（10）：e184205.

[9]Sugai T，Habano W，Takagi R，et al.Analysis of molecular alterations in laterally spreading tumors of the colorectum[J].J Gastroenterol，2017，52（6）：715-723.

[10]鐘選芳，張曉慧，甘愛(ài)華，等.大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤的臨床和病理特征回顧性研究[J].中華消化內(nèi)鏡雜志，2015， 32（9）：624-625.

[11]Sakai E，F(xiàn)ukuyo M，Matsusaka K，et al.TP53 mutation at early stage of colorectal cancer progression from two types of laterallyspreading tumors[J].Cancer Sci，2016，107（6）：820-827.

[12]Sugimoto T，Ohta M，Ikenoue T，et al.Macroscopic morphologic subtypes of laterallyspreadingcolorectal tumors showing distinct molecular alterations[J].Int J Cancer，2010，127（7）：1562-1569.

[13]Shi L，Wu YX，Yu JH，et al.Research of the relationship between β-catenin and c-myc-mediated Wnt pathway and laterallyspreading tumors occurrence[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（2）：252-257.

[14]Nagai K，Hayashi Y，Honma K，et al.Adenoma of colorectal laterally spreading tumor nongranular type with biological phenotypic features similar to cancer[J].J Gastroenterol Hepatol，2018，33（11）：1853-1863.

[15]Sakai E，Ohata K，Chiba H，et al.Methylation epigenotypes and genetic features in colorectal laterally spreading tumors[J].Int J Cancer，2014，135（7）：1586-1595.

（收稿日期：2019-02-18 本文編輯：崔建中）