肝損傷動物模型的研究進展

徐博 田晶 馬寧

[摘要]近年來肝病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴重影響患者的生存質(zhì)量。目前尋求治療肝損傷藥物的基礎(chǔ)是如何建立疾病的動物模型，本文通過分析近幾年有關(guān)肝損傷方面的文獻，總結(jié)急性肝損傷、慢性肝損傷、藥物性肝損傷、酒精性肝損傷的造模方法并探討肝損傷的機制，現(xiàn)作以下綜述。

[關(guān)鍵詞]肝損傷；急性；慢性；進展

[中圖分類號] R965.1 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2019）5（b）-0038-04

Progress in animal models of liver injury

XU Bo1 TIAN Jing1 MA Ning1 WU Wei-nan2

1. Experimental center， Basic Medical College of Jilin Medical College， Jilin Province， Jilin 132013， China； 2. Department of General Surgery， Jilin Central Hospital of Jilin Province， Jilin 132011， China

[Abstract] In recent years， the incidence of liver disease is increasing year by year， which seriously affects the quality of life of patients. How to establish animal models of diseases is the basis of searching for drugs to treat liver injury， by analyzing the literatures about liver injury in recent years， to summarize the methods of establishing models of acute liver injury， chronic liver injury， drug-induced liver injury and alcoholic liver injury， and to explore the mechanism of liver injury.

[Key words] Liver injury； Acute； Chronic； Progress

近年來，肝臟疾病已經(jīng)成為威脅人類健康的常見疾病之一。導(dǎo)致肝損傷的因素有很多，主要有以下幾點：抗結(jié)核藥物引起藥物性肝損傷、酗酒引起的酒精性肝損傷、化學(xué)試劑引起的化學(xué)性肝損傷。由于個體免疫功能有所差別，會出現(xiàn)不同程度的肝損傷。免疫功能弱的人群多數(shù)會發(fā)展成為慢性肝損傷，肝細胞不斷遭到破壞，最終會導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。免疫功能強的人群會發(fā)展成為急性肝損傷。建立肝損傷動物模型是研究肝損傷機制和尋找治療肝損傷藥物的一個重要方法。本文通過總結(jié)近幾年肝損傷動物模型的制備方法，為進一步研究肝損傷提供新視角。

1四氯化碳誘導(dǎo)急性肝損傷模型

1.1四氯化碳誘導(dǎo)急性肝損傷模型的相關(guān)機制

四氯化碳導(dǎo)致小鼠急性肝損傷主要是破壞了小鼠的肝細胞，肝細胞內(nèi)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）透過肝細胞膜進入血液，導(dǎo)致血液中轉(zhuǎn)氨酶活性升高。正常情況下，ALT和AST分別存在于肝細胞質(zhì)和肝細胞線粒體內(nèi)，只有極少量入血。杜斌等[1]研究顯示，當(dāng)肝組織受到急性損傷或細胞膜通透性增加時，ALT和AST大量進入血液。有研究顯示，四氯化碳可以通過細胞色素P450系統(tǒng)的生物轉(zhuǎn)化[2]，產(chǎn)生高能反應(yīng)，從而誘發(fā)急性肝損傷。

1.2造模方法及結(jié)果

盛云華等[3]給小鼠腹腔注射16 mg/kg四氯化碳植物油造模，造模的體積為10 ml/kg。陰性小鼠給予植物油灌胃，禁食不禁水。周迎春[4]用1%四氯化碳花生油溶液給小鼠灌胃，灌胃的劑量為0.1 ml/10 g。此外，谷寧寧[5]對大鼠腹腔注射四氯化碳，導(dǎo)致大鼠急性肝損傷。造模前，小鼠的飲食、活動及精神狀態(tài)良好。造模后，小鼠狀態(tài)發(fā)生改變，但體重改變不大。通過眼球取血，檢測血清中ALT、AST的酶活性，判斷造模是否成功。結(jié)果顯示，腹腔注射不同濃度的四氯化碳可使血清中ALT和AST的酶活性升高，ALT升高明顯，1%肝細胞損傷時ALT水平即升高一倍[6]，只有肝細胞損傷達到一定程度才升高血清中的AST。腹腔注射不同濃度的四氯化碳可以建立急性肝損傷的動物模型。

2對乙酰氨基酚誘導(dǎo)急性肝損傷模型

2.1對乙酰氨基酚誘導(dǎo)急性肝損傷模型的機制

對乙酰氨基酚（APAP）的毒性與肝內(nèi)代謝有關(guān)。在肝內(nèi)，少量APAP可以被CYP2E1酶降解為高毒性的活性代謝物N-乙酰-對-苯醌亞胺（NAPQI）。少劑量的NAPQI可以被線粒體中的內(nèi)谷胱甘肽（GSH）解除毒性。張冬梅等[7]得出對乙酰氨基酚誘導(dǎo)小鼠肝損傷的機制為當(dāng)APAP過量時，其代謝過程產(chǎn)生大量的NAPQI，超過了GSH的解毒能力，未被清除的NAPQI與細胞內(nèi)線粒體結(jié)合，破壞線粒體膜并最終導(dǎo)致肝細胞壞死。有研究顯示[8]，當(dāng)APAP代謝產(chǎn)生的NAPQI超過細胞的解毒能力時，細胞內(nèi)堆積大量的自由基，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.2造模方法及結(jié)果

潘海華等[9]在末次給藥12 h后對小鼠腹腔注射500 mg/kg APAP溶液進行造模。鄭惠星[10]也通過腹腔注射APAP溶液的方法造模，造模劑量為300 mg/kg。此外，劉華等[11]在末次給藥30 min后對大鼠皮下注射450 mg/kg APAP溶液制造大鼠急性肝損傷模型。造模前，肝細胞完整，肝組織完好，肝小葉正常。造模后，肝小葉周圍的肝細胞出現(xiàn)壞死，肝細胞的正常形態(tài)被破壞。光學(xué)顯微鏡中結(jié)果顯示，肝小葉內(nèi)細胞有浸潤現(xiàn)象，肝小葉內(nèi)存在炎癥。在APAP處理4 h的時候肝細胞出現(xiàn)嚴重壞死。生化指標(biāo)檢測顯示，血清中ALT和AST的濃度均上升，GSH的濃度降低。

3 ConA誘導(dǎo)慢性肝損傷模型

3.1 ConA誘導(dǎo)慢性肝損傷模型的機制

ConA誘導(dǎo)的肝損傷與免疫應(yīng)答有關(guān)。趙晨翔等[12]得出ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷的機制為刀豆蛋白與肝竇內(nèi)巨噬細胞結(jié)合，使T淋巴細胞進入肝竇，釋放炎性介質(zhì)，損傷肝細胞。肝細胞膜被破壞，肝細胞內(nèi)ALT、AST大量進入血液，ALT、AST濃度隨著ConA劑量的增加而升高。

3.2造模方法及結(jié)果

文獻研究結(jié)果顯示[13]，采用ConA以10 mg/kg（1 g/LPBS溶液）對小鼠進行尾靜脈注射，每周1次，連續(xù)注射4周，制造小鼠慢性肝損傷模型。趙燕平等[14]采用5 mg/kg ConA對小鼠進行尾靜脈注射，隔天1次，共兩周，誘發(fā)小鼠肝損傷模型。摘取小鼠眼球取血，通過測定血清中ALT、AST的含量，發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)氨酶的濃度均上升，且轉(zhuǎn)氨酶的活性均升高。造模4 h后可觀察到模型組肝細胞炎性活動度增加，肝臟壞死處有大量的炎性細胞、淋巴細胞浸潤。肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝索消失，肝小葉內(nèi)細胞形態(tài)發(fā)生改變，模型動物的肝臟出現(xiàn)纖維化癥狀，ConA造模成功。

4抗結(jié)核藥物（異煙肼聯(lián)合利福平）誘導(dǎo)肝損傷模型

4.1抗結(jié)核藥物（異煙肼聯(lián)合利福平）誘導(dǎo)肝損傷模型的機制

郭瑤雪等[15]研究顯示，異煙肼可以降低甚至抑制線粒體呼吸鏈中酶的活性。打破線粒體的正常功能，使線粒體損傷，干擾細胞能量代謝，導(dǎo)致細胞凋亡。文獻研究顯示[16]，異煙肼和利福平導(dǎo)致肝損傷的機制是通過激活死亡因子受體（Fas）介導(dǎo)的死亡通路，誘導(dǎo)肝細胞大量凋亡，肝細胞內(nèi)的ALT和AST大量入血，血液中轉(zhuǎn)氨酶活性上升。

4.2造模方法及結(jié)果

陳婭等[17]用異煙肼+利福平各50 mg/kg給BW大鼠灌胃，建立大鼠的肝損傷模型。朱凌妍等[18]通過給予成年大鼠55 mg/kg的異煙肼藥物1次/d，連續(xù)給藥28 d，建立大鼠肝損傷模型。低劑量的異煙肼灌胃導(dǎo)致大鼠的肝細胞出現(xiàn)脂肪變性和水腫，高劑量異煙肼導(dǎo)致大鼠死亡。HE染色后顯微鏡下觀察肝組織顯示，肝細胞的胞漿比較疏松，肝組織大部分呈碎片狀壞死，肝索消失，肝血竇變窄或幾乎消失，肝細胞損傷嚴重。生化指標(biāo)顯示，大鼠血清中ALT和AST濃度明顯升高，血清中各種酶的活性升高，肝損傷造模成功。

5酒精誘導(dǎo)肝損傷模型

5.1酒精性肝損傷模型的機制

酒精在肝臟內(nèi)的代謝可產(chǎn)生大量自由基。過量的自由基可氧化生物膜脂質(zhì)，破壞線粒體膜和肝細胞膜，導(dǎo)致ALT和AST大量入血。何志剛等[19]研究顯示，攝入過量酒精產(chǎn)生的腸源性內(nèi)毒素可活化核因子κB（NF-κB）炎癥信號通路。檢測酒精性肝損傷的指標(biāo)有丙二醛（MDA）、GSH、血清超氧化物歧化酶（SOD）、三酰甘油（TG）[20-21]。MDA可作為反映機體組織或細胞受自由基攻擊和損傷的指標(biāo)；GSH和SOD活力的高低可以反映機體清除自由基和抗氧化能力的高低；TG可作為脂肪堆積的指標(biāo)；乙醇在乙醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙酸，抑制三羧酸循環(huán)，導(dǎo)致脂肪堆積，肝組織TG指標(biāo)上升。

5.2酒精導(dǎo)致的急性肝損傷模型造模方法及結(jié)果

彭國霞等[22]用5.0 g/kg酒精給小鼠灌胃，建立小鼠急性肝損傷模型。漆樂媛等[23]在末次給藥后2 h，給小鼠灌胃15 ml/kg白酒，每12 h灌胃1次，一共兩次，成功造模。造模后的小鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動遲緩、嗜睡、走路不平穩(wěn)、呼吸急促等醉酒狀態(tài)。7 h后小鼠逐漸恢復(fù)清醒狀態(tài)，取小鼠肝臟稱重，模型小鼠的肝臟重于空白組小鼠。顯微鏡下觀察小鼠肝組織顯示，肝組織中央靜脈及小葉間靜脈周圍出現(xiàn)肝細胞腫大[24]，肝索紊亂，肝血竇變窄或消失，肝細胞的胞漿比較疏松，呈水樣變性及炎性細胞浸潤。生化指標(biāo)檢測顯示，ALT、AST、MDA、TG的濃度均升高，GSH和SOD濃度下降。

5.3酒精導(dǎo)致的慢性肝損傷模型造模方法及結(jié)果

陳志亮等[25]用0.7 ml/100 g 30%的乙醇每日定時給大鼠灌胃，建立大鼠慢性肝損傷模型。官堂明等[26]在每次給藥6 h后，用體積分數(shù)為50%的乙醇溶液灌胃，灌胃的劑量12 ml/kg，成功建立小鼠慢性肝損傷模型。有文獻研究顯示[27]，可以用梯度乙醇濃度對小鼠灌胃來建立小鼠酒精性慢性肝損傷的模型。何志剛等[28]用0.1 ml/10 g 30%的乙醇對小鼠進行灌胃，每5天增加5%的濃度，直到45%，成功建立了小鼠慢性肝損傷的模型。大鼠毛發(fā)色澤差，食欲缺乏，肝臟較暗。顯微鏡下觀察組大鼠的肝小葉內(nèi)可見灶狀壞死，壞死的部位多在中央靜脈周圍。肝細胞壞死多，壞死區(qū)內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，中性粒細胞浸潤明顯。王軍偉等[29]研究顯示，模型組大鼠血清中ALT和AST水平明顯上升。

6總結(jié)

在四氯化碳急性肝損傷模型中，采取四氯化碳植物油進行灌胃或者腹腔注射的方法（在配置溶液時要注意四氯化碳不易溶于植物油，所以要充分混勻，且現(xiàn)配現(xiàn)用），灌胃的劑量為0.1 ml/10 g，腹腔注射的劑量為16 mg/kg。在對乙酰氨基酚急性肝損傷模型中，采取腹腔注射或皮下注射的方法，腹腔注射的劑量為500 mg/kg或300 mg/kg，皮下注射的劑量為450 mg/kg。在ConA慢性肝損傷模型中，采取尾靜脈注射的方法造模，造模劑量為10 mg/kg或5 mg/kg。在抗結(jié)核藥物模型中，用異煙肼+利福平各50 mg/kg·BW灌胃或55 mg/kg異煙肼持續(xù)給藥，成功建立肝損傷模型。在酒精性肝損傷模型中，采取灌胃的方法造模，急性肝損傷的造模劑量為5.0 g/kg或15 ml/kg，慢性肝損傷的造模劑量為0.7 ml/100 g（30%乙醇）或12 ml/kg（50%乙醇）。在造模過程中，衡量造模結(jié)果的生化指標(biāo)是血清中ALT和AST的濃度，在對乙酰氨基酚和酒精性肝損傷模型中，SOD和GSH的濃度也是衡量造模是否成功的標(biāo)準。

綜上所述，不同類型的肝損傷必須要采取不同的造模方法。不同肝損傷模型有助于研究治療肝損傷的藥物和治療方法，為研究肝損傷提供開辟新視覺，為解決人類肝臟疾病提供實驗基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-11-02 本文編輯：劉克明）