線性掃描極譜法檢測(cè)環(huán)境水體中呋喃西林

陳春香, 陳 文， 熊旭堯

(1.成都理工大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，四川成都 610059; 2.四川省礦產(chǎn)資源化學(xué)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610059)

呋喃西林(Nitrofurazone，NF)屬于硝基呋喃類藥物，它是一種人工合成的具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥，曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用于家禽、家畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物傳染病的預(yù)防和治療，也曾用作飼料藥物添加劑[1]。研究發(fā)現(xiàn)，呋喃西林的代謝產(chǎn)物氨基脲具有致癌等作用，嚴(yán)重危害人體健康[2 - 4]。歐盟在1995年就規(guī)定禁止該類藥物在食物中使用，并于2003年確定水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物的最大殘留限量為1.0 μg/kg[5]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部也在2002年公布的《食品動(dòng)物禁用獸藥及其他化合物清單》中規(guī)定呋喃西林抗生素在所有動(dòng)物源性食品中禁止使用，且對(duì)該類藥物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)也有明確的規(guī)定[6 - 7]。因此，出于對(duì)人們健康的考慮以及對(duì)水產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)督，建立一個(gè)對(duì)養(yǎng)殖水體中的呋喃西林進(jìn)行快速、高效、靈敏檢測(cè)的方法具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

目前檢測(cè)呋喃西林的方法主要有：高效液相色譜法[3 - 4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5 - 6]、分光光度法[7 - 8]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)[9 - 10]以及電化學(xué)檢測(cè)法[11 - 14]。電化學(xué)方法具有檢測(cè)簡(jiǎn)便、分析速度快、分析成本低、靈敏度高、易于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)和在線檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。特別是極譜法具有檢測(cè)方便、操作費(fèi)用低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。Reday等[11]使用直流極譜法、循環(huán)伏安法和差示脈沖極譜法研究了在pH為2.0到12.0的緩沖液中呋喃西林的電化學(xué)還原行為，并用于藥物制劑的分析。本研究在前人工作的基礎(chǔ)上，以養(yǎng)殖水體中的呋喃西林為分析對(duì)象，進(jìn)行了更加詳細(xì)的研究，建立了檢測(cè)養(yǎng)殖水體中呋喃西林的極譜分析新方法，該方法其檢出限更低，檢測(cè)線性范圍更寬。同時(shí)，對(duì)電極反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了初步討論。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

JP-303型示波極譜儀(成都儀器廠)，三電極體系：滴汞電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極；PXS-1離子活度計(jì)(成都世紀(jì)方舟科技有限公司)；BS 2245型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

N′N - 二甲基甲酰胺(DMF)溶液(1.99%)的配制：準(zhǔn)確移取2.0 mL DMF(純度為99%)于1 000 mL容量瓶中，并用蒸餾水稀釋至刻度。呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(200.0 μg/mL)的配制：準(zhǔn)確稱取0.1023 g呋喃西林，溶解于20.0 mL DMF，然后移入1 000 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。1.0 μg/mL呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由儲(chǔ)備液用1.99%DMF逐級(jí)稀釋而成。B - R緩沖溶液、Na2HPO4- 檸檬酸緩沖溶液、H3PO4- NaH2PO4緩沖溶液、鄰苯二甲酸 - 鹽酸緩沖溶液、甘氨酸 - 鹽酸緩沖溶液，pH均為2.70。Triton X-100溶液、十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)溶液、十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液、聚乙二醇400溶液、聚乙烯吡咯烷酮K90溶液，濃度均為0.01%。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

向25 mL比色管中，依次加入一定量的呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)溶液或適量樣品溶液，7.0 mL B - R緩沖溶液(pH=2.70)，0.5 mL 0.01%SDS溶液，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。取適量溶液倒入小燒杯中，在JP-303型極譜儀上，于起始電位-0.666 V(vs.SCE)，以掃描速率0.900 V/s，在靜止時(shí)間12 s，汞柱高度46 cm，掃描次數(shù)4次，量程2.0×102～4.0×103nA的條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄其二階導(dǎo)數(shù)波峰的峰電位與峰電流。

2 結(jié)果與討論

2.1 底液的選擇

2.1.1 溶劑的種類及用量分別選擇乙醇[15]和DMF[11]作為溶劑，考察溶劑的種類對(duì)呋喃西林峰電流的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以DMF作溶劑，可以得到更為靈敏穩(wěn)定的還原峰，故本研究選擇DMF為溶劑。進(jìn)一步以濃度為1.99%、7.96%、15.92%的DMF為溶劑配制濃度為0.2 μg/mL(低)和2.0 μg/mL(高)的呋喃西林溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法，在pH=2.52～2.89范圍內(nèi)，測(cè)定其峰電流，考察DMF濃度的影響。結(jié)果表明，DMF濃度越低，呋喃西林的峰電流越大，當(dāng)DMF濃度為1.99%時(shí)，高、低濃度的呋喃西林的峰電流響應(yīng)均最大。但DMF用量越少，呋喃西林的溶解性變差。因此，本研究兼顧峰電流較大且配制方便而選擇1.99%的DMF作為最佳溶劑濃度用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 pH對(duì)峰電流的影響Fig.1 The effect of pH on peak current

2.1.2 最佳pH分別配制0.2 μg/mL(低)和2.0 μg/mL(高)的呋喃西林溶液，使用0.01 mol/L HCl和0.01 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，考察體系酸度對(duì)呋喃西林峰電流的影響，如圖1。由圖1可知，溶液的酸度對(duì)高、低兩種濃度呋喃西林的峰電流影響大致相同。本實(shí)驗(yàn)選擇pH=2.70為體系的最佳測(cè)定pH值。

2.1.3 緩沖溶液的種類及用量分別考察了pH=2.70的B - R緩沖溶液、甘氨酸 - HCl緩沖溶液、鄰苯二甲酸 - HCl緩沖溶液、H3PO4- NaH2PO4緩沖溶液、Na2HPO4- 檸檬酸緩沖溶液5種緩沖溶液對(duì)峰電流的影響。結(jié)果顯示呋喃西林在B - R緩沖溶液(pH=2.70)中，峰電流響應(yīng)最好，故本實(shí)驗(yàn)選擇pH=2.70的B-R緩沖溶液。配制0.2 μg/mL(低)和2.0 μg/mL(高)的呋喃西林溶液，分別加入不同體積的B - R緩沖溶液(pH=2.70)，考察緩沖溶液用量對(duì)峰電流的影響。結(jié)果顯示：用量為6.0～8.0 mL時(shí)，高、低濃度呋喃西林的峰電流較高且穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)選擇B - R緩沖溶液的加入量為7.0 mL。

2.1.4 表面活性劑的種類及用量檢測(cè)濃度較低的呋喃西林時(shí)，在檢測(cè)峰前出現(xiàn)極譜極大，對(duì)其峰形產(chǎn)生一定的干擾。在溶液中加入適量的極大抑制劑可以消除這個(gè)干擾。但研究發(fā)現(xiàn)，加入極大抑制劑的量會(huì)明顯改變峰電流的大小[16]。分別試驗(yàn)濃度均為0.01%的Triton X-100、CTMAB、SDS、聚乙二醇400、聚乙烯吡咯烷酮K90 5種不同類型的表面活性劑，考察他們的用量對(duì)呋喃西林峰電流的影響。結(jié)果顯示，SDS是該實(shí)驗(yàn)的最佳表面活性劑。SDS的加入量在0.40～0.60 mL之間時(shí)，峰電流穩(wěn)定且相對(duì)較高。高、低濃度的呋喃西林均能得到較穩(wěn)定的極譜峰。故選擇0.50 mL作為最佳的用量。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

按照實(shí)驗(yàn)方法，在最佳底液的條件下對(duì)0.2 μg/mL(低)和2.0 μg/mL(高)兩個(gè)濃度的呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別考察了汞柱高度、掃描速率、起始電位、靜止時(shí)間對(duì)峰電流的影響，在31～46 cm范圍內(nèi)改變汞柱高度，在0.5～0.8 V/s范圍內(nèi)改變電極掃描速率，在0.1～-0.8 V范圍內(nèi)改變起始電位，在2～12 s內(nèi)改變滴汞靜止時(shí)間，選擇出本研究最佳的儀器及溫度條件為：汞柱高度：46 cm；掃描速率：0.900 V/s；起始電位：-0.666 V；靜止時(shí)間：12 s。

2.3 溫度與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在3～50 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，2.0 μg/mL(高)、0.2 μg/mL(低)濃度呋喃西林的峰電流整體呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明低溫對(duì)呋喃西林的分析有利。但是考慮常溫下的檢測(cè)靈敏度也能滿足分析的要求，本實(shí)驗(yàn)選擇在室溫條件下進(jìn)行測(cè)定。在不同的靜置時(shí)間測(cè)定敞開和密閉體系下呋喃西林的峰電流，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液處于密閉容器中，在3 h內(nèi)高、低濃度均能獲得準(zhǔn)確穩(wěn)定的檢測(cè)值。分析在3 h內(nèi)進(jìn)行。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

按照實(shí)驗(yàn)方法配制一系列濃度的呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測(cè)定其峰電流并對(duì)呋喃西林的濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。呋喃西林在0.02～1.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)的峰電流與其濃度具有良好的線性關(guān)系，方程為：Ip″(×102nA)=17.957c(μg/mL)+0.6772(R2=0.9907)，而在0.02～6.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，則成良好的多項(xiàng)式關(guān)系。擬合后的三次多項(xiàng)式方程為：Ip″(×102nA)=0.22099c3-3.34452c2+19.4922c(R2=0.99868)，可用于測(cè)定樣品中呋喃西林的含量。

在最佳條件下，按照實(shí)驗(yàn)方法，配制濃度為0.02 μg/mL的呋喃西啉溶液，連續(xù)測(cè)定10次。根據(jù)檢出限(DL)公式，DL=kSb/|S|(k取常數(shù)3，Sb=0.007966，S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)，計(jì)算可得，建立的測(cè)定呋喃西林含量的電化學(xué)新體系檢出限為0.0013 μg/mL。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

分別配制6份0.2 μg/mL(低)和2.0 μg/mL(高)的呋喃西林溶液，測(cè)定其峰電流。測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在1.39%～1.63%范圍內(nèi)，說(shuō)明該方法的重現(xiàn)性較好，具有較高的精密度。

2.6 共存物質(zhì)的影響

在最佳底液條件和儀器條件下，考察了一些可能共存的離子和幾種常見(jiàn)的治療魚類疾病的藥物等對(duì)0.2 μg/mL呋喃西林溶液測(cè)定的影響。在允許誤差±5%的范圍內(nèi)，確定干擾物質(zhì)的最大濃度(μg/mL)。由表1得出，陰離子對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾較小。而陽(yáng)離子Mg2+、Ca2+、Ba2+、Cu2+、Fe3+、Al3+、Ni2+、Zn2+、Cd2+和一些治療魚類疾病的藥物如呋喃唑酮、孔雀石綠對(duì)分析的干擾較大。對(duì)于陽(yáng)離子干擾組分，進(jìn)行EDTA 絡(luò)合掩蔽。呋喃唑酮的存在會(huì)使呋喃西林的峰電流增大，而其他物質(zhì)則會(huì)抑制呋喃西林的峰電流，但是因其與呋喃西林具有同樣的作用，一般較難同時(shí)使用，其干擾可以忽略。

表1 共存物質(zhì)的干擾

2.7 樣品分析

采集成都理工大學(xué)附近某兩超市水產(chǎn)品水池中水樣、戶外魚塘的水樣，對(duì)樣品進(jìn)行前處理后進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)選擇0.01 mol/L EDTA作為掩蔽劑，采用絡(luò)合掩蔽的方法來(lái)減小某些干擾離子對(duì)測(cè)定結(jié)果造成的影響。

2.7.1 樣品前處理在某超市水產(chǎn)水池和成都理工大學(xué)旁的魚塘隨機(jī)采集250 mL水樣，靜置，離心以徹底使懸浮顆粒與水體分離。各取5.0 mL澄清水樣于比色管中，在超市水樣中加入1.5 mL 0.01 mol/L EDTA，在魚塘水樣中加入3.0 mL 0.01 mol/L EDTA，搖勻。

2.7.2 樣品的測(cè)定在最佳底液及儀器條件下，按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)水樣進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。由表2可知，6組樣品溶液中均未檢出呋喃西林。呋喃西林的加標(biāo)回收率在95.71%～107.20%之間。說(shuō)明本文方法測(cè)定呋喃西林含量，具有較高的準(zhǔn)確度。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)(n=3)

ND:not detecteld.

3 極譜波性質(zhì)及機(jī)理

圖2 不同體系的二階導(dǎo)數(shù)極譜圖Fig.2 Second-order derivate polarograms of different systems

3.1 極譜行為

在最佳儀器條件下，檢測(cè)呋喃西林、B-R、SDS、DMF、呋喃西林+SDS與B-R+SDS都未見(jiàn)還原峰出現(xiàn)，但是呋喃西林+B-R出現(xiàn)了較強(qiáng)的還原峰，當(dāng)加入SDS后峰形相同，峰電流略微有一些下降，因?yàn)镾DS對(duì)峰電流有抑制作用(圖2)。由此說(shuō)明檢測(cè)的是呋喃西林的還原峰，并且只有加入緩沖溶液后，呋喃西林才會(huì)出現(xiàn)還原峰，說(shuō)明呋喃西林只有在一定酸度支持電解質(zhì)的存在下，才可以還原。此峰為定量檢測(cè)呋喃西林含量的依據(jù)。

3.2 循環(huán)伏安圖

按照實(shí)驗(yàn)方法，配制濃度為2.0 μg/mL的呋喃西林溶液，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。結(jié)果顯示：正向掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)在-0.101 V處出現(xiàn)一個(gè)還原峰，而反向掃描時(shí)無(wú)氧化峰出現(xiàn)，說(shuō)明該還原過(guò)程完全不可逆。

3.3 電化學(xué)行為分析

3.3.1 掃描速率與峰電流的關(guān)系按照實(shí)驗(yàn)方法，配制濃度為2.0 μg/mL的呋喃西林溶液，固定其它條件，在0.1～1.0 V/s范圍內(nèi)改變掃描速率，結(jié)果顯示掃描速率與峰電流成良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：Ip″(×102nA)=11.00679v(V/s)+3.90127(R2=0.94687)。峰電位與lnv呈負(fù)的線性關(guān)系，且掃速增加，峰電位負(fù)移，其線性回歸方程為：Ep(mV)=-23.14326lnv-993.11540(R2=0.95753)。測(cè)定過(guò)程中隨溫度的降低，峰電流升高，且加入少量的非離子表面活性劑Triton X-100及陽(yáng)離子表面活性劑CTMAB，峰電流均下降，而加入少量的陰離子表面活性劑SDS后，峰電流增加，說(shuō)明呋喃西林在電極上有吸附特性。掃描速率的平方根也與峰電流呈良好的線性關(guān)系，方程為：Ip″(×102nA)=15.16341v1/2-0.18750(R2=0.98897)。說(shuō)明該電極反應(yīng)過(guò)程既受吸附控制，也受擴(kuò)散控制[11 - 17]。

3.3.2 pH值對(duì)極譜波的影響考察峰電位隨pH值的變化情況，發(fā)現(xiàn)呋喃西林的還原峰電位隨著溶液pH值的增加呈負(fù)移的趨勢(shì)，且成線性關(guān)系，線性方程為：Ep(mV)=-84.41344pH-739.62012(R2=0.98367)。說(shuō)明在此酸度范圍內(nèi)，電極反應(yīng)過(guò)程中有質(zhì)子參與反應(yīng)[11]。

4 結(jié)論

本研究建立了新的檢測(cè)呋喃西林的線性掃描極譜新方法，呋喃西林的標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍為0.02～6.00 μg/mL，檢出限為0.0013 μg/mL。該方法具有較高的精密度和穩(wěn)定性。其加標(biāo)回收率在95.71%～107.20%之間，具有較高的準(zhǔn)確度。