電針風(fēng)池穴對腦缺血再灌注大鼠突觸素、生長相關(guān)蛋白-43的影響

韓清,徐鳴曙,張英杰,徐佳,葛林寶

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電針風(fēng)池穴對腦缺血再灌注大鼠突觸素、生長相關(guān)蛋白-43的影響

韓清1,徐鳴曙2,張英杰2,徐佳3,葛林寶4,5

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院,上海 201508;2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437;4.上海市氣功研究所,上海 200030;5.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究中心,上海 201203)

觀察電針風(fēng)池穴對腦缺血再灌注大鼠突觸素(synaptophysin, SYN)、生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43, GAP-43)表達(dá)變化的影響。將32只SD雄性大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、電針組,每組8只。模型組和電針組采用線栓法制作腦缺血再灌注模型。采用電針雙側(cè)風(fēng)池穴對電針組大鼠進行治療,每日1次,每次30 min,至動物處死。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測SYN和GAP-43的表達(dá)。模型組和電針組造模后2 h和造模后6 d Bederson評分與正常組和假手術(shù)組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。模型組和電針組造模后6 d海馬和皮層SYN IOD值和GAP-43 IOD值與正常組和假手術(shù)組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。電針組造模后6 d海馬和皮層SYN IOD值和GAP-43 IOD值與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。電針風(fēng)池穴可促進腦缺血再灌注模型大鼠的GAP-43和SYN的表達(dá),表明電針可以促進軸突再生,對突觸的可塑性具有正向改善作用。

針刺療法;電針;穴,風(fēng)池;腦缺血;再灌注損傷;突觸素;生長相關(guān)蛋白-43

卒中是近年來嚴(yán)重威脅人類健康的三大疾病之一,呈現(xiàn)出高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率的三高特征。缺血性卒中占卒中70%以上[1-2]。隨著老年人在社會人群中的比例不斷上升,其發(fā)病率仍會進一步上升。醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步雖然在一定程度上減少了死亡率,但也一定程度上增加了中風(fēng)病的致殘率水平,給社會和家庭造成巨大負(fù)擔(dān)。相關(guān)研究表明,神經(jīng)系統(tǒng)對機體內(nèi)、外環(huán)境變化進行適應(yīng)或應(yīng)變而發(fā)生結(jié)構(gòu)與功能變化稱為神經(jīng)可塑性[3],而突觸是神經(jīng)可塑性變化的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)部位。突觸素(synaptophysin, SYN)是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能均有密切聯(lián)系的磷酸蛋白,其主要存在于神經(jīng)元突觸前囊泡,在突觸囊泡的轉(zhuǎn)運、導(dǎo)入及遞質(zhì)的釋放中發(fā)揮重要作用,是突觸小泡特異性蛋白。SYN既可以影響突觸結(jié)構(gòu),又參與了突觸囊泡轉(zhuǎn)運和排放過程,由此實現(xiàn)了調(diào)控突觸傳遞的效能,從而在突觸可塑性中起一定作用[4]。故SYN是公認(rèn)的神經(jīng)可塑性的主要標(biāo)記物。而神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43, GAP-43)是一種廣泛存在于神經(jīng)元軸突內(nèi)的特異性磷酸蛋白,在神經(jīng)生長發(fā)育和再生過程中大量合成[5],通過參與調(diào)節(jié)生長錐形態(tài)而促進軸突生長。國際上將GAP-43作為神經(jīng)元軸突再生的分子標(biāo)志,是神經(jīng)可塑性研究的首選分子探針[6]。本研究觀察電針風(fēng)池穴對腦缺血再灌注大鼠SYN和GAP-43表達(dá)變化的影響,探索電針治療缺血性卒中的作用機制,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選用8周齡健康雄性清潔級Spraguer-dawley(SD)大鼠32只,體重240～280 g,由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實驗動物中心提供。所有大鼠均按照清潔級標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng),每籠飼養(yǎng)4只,室溫控制在22℃～25℃,濕度40%～70%,明暗光照比為12 h:12 h。大鼠可進行自由飲水,每日每只飲食20 g。按照隨機、對照原則,采用完全隨機實驗設(shè)計方法,運用SPSS 19.0軟件將大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組和電針組,每組8只。實驗周期為7 d。

1.2 主要儀器與試劑

ECLIPSE TI-SR倒置熒光顯微鏡(日本尼康株式會社);華佗牌針灸針(0.25 mm×13 mm,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);G6805-1A電針治療儀(上海華誼醫(yī)用儀器廠);RM2016病理切片(上海徠卡儀器有限公司);KD-P組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)。

75%乙醇(杭州歐拓普生物技術(shù)有限公司);無水乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);EDTA抗原修復(fù)液(武漢谷歌生物科技有限公司);BSA(A7030,美國Sigma公司);蘇木素染液(武漢谷歌生物科技有限公司);一抗(SYN,ab32127,稀釋比為1:500,英國Abcam);二抗(HRP-山羊抗兔/鼠二抗,K5007,丹麥DAKO公司);組化試劑盒DAB顯色劑(K5007,丹麥DAKO公司)。

1.3 模型制備

實驗大鼠飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)環(huán)境。術(shù)前大鼠禁食12 h,室溫保持在25℃,用水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉。參考Longa EZ等[7]報道的線栓法大腦中動脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO)進行造模。手術(shù)完成后,將大鼠置于室內(nèi)溫度保持在25℃環(huán)境中蘇醒。

正常組不做任何處理;假手術(shù)組大鼠用水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后分離出右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈,然后縫合。

1.4 神經(jīng)功能缺損評分

采用Bederson評分法,時間點選擇造模前、造模后2 h及造模后6 d。具體方法為,提鼠尾離開地面約50 cm,觀察前肢屈曲情況,如雙前肢對稱伸向地面,記為0分;如手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)肩或(和)肘內(nèi)收屈曲,肩關(guān)節(jié)內(nèi)旋,或者肩肘關(guān)節(jié)屈曲同時伴有內(nèi)旋者,記為1分。將大鼠放在光滑平面上,手推雙肩分別向另一側(cè)移動,檢測兩側(cè)側(cè)推阻力并對比,如兩側(cè)側(cè)推阻力對等且有力記為0分;若向腦損傷對側(cè)推動時阻力下降者,記為1分。將大鼠兩前肢放于金屬網(wǎng)上,觀察對比兩前肢的肌張力大小,兩前肢肌張力近似相等且力量充足者為0分;如腦損傷對側(cè)前肢肌張力下降,記為1分。將大鼠提尾距離平面約50 cm高度,若大鼠有不停地向腦損傷對側(cè)一個方向旋轉(zhuǎn)者,記為1分。滿分為4分,分?jǐn)?shù)越高表示大鼠行為障礙越嚴(yán)重[8-9]。

1.4.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

動物蘇醒后,運用Bederson改進評分法對所有大鼠進行評分,2～4分為有效模型。

1.4.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

①動物死亡;②神經(jīng)缺損評分＜2分;③術(shù)后1 d大鼠體重快速下降到200 g以下。

1.5 干預(yù)方法

在術(shù)后1 d即對電針組實驗大鼠進行電針治療[10]。取雙側(cè)風(fēng)池穴。常規(guī)消毒后,采用0.25 mm×13 mm毫針直刺3 mm,然后將針柄分別連接至電針儀,采用疏密波,頻率為2～10 Hz,電流強度為1～3 mA,電壓為3～5 V,強度以大鼠雙耳稍稍顫動為度,治療時間30 min。每日1次,均在上午10時左右進行,連續(xù)治療5 d。治療完畢將大鼠放入籠內(nèi)。

假手術(shù)組和模型組不治療;模型組和電針組大鼠每只單獨飼養(yǎng),并予以高能量飲食。

1.6 標(biāo)本采集

分別于動物造模腦缺血6 d后,采用10%用水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉大鼠,打開胸腔迅速暴露心臟,經(jīng)左心室生理鹽水灌洗后,再行4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注固定,后于冰上迅速小心斷頭取腦,在視交叉后切開,冠狀切取2 mm厚包含皮質(zhì)梗死灶區(qū)域;距離大腦皮質(zhì)后緣向前約5 mm位置,鈍性剝離皮質(zhì),暴露并取缺血側(cè)海馬,冠狀切取2 mm厚組織;將所取組織置于4%多聚甲醛液體中固定,后進行脫水、透明、浸蠟、包埋,將石蠟包埋塊切成5mm厚防脫切片,用于免疫組織化學(xué)染色。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

免疫組化染色步驟如下,石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水;檸檬酸抗原修復(fù)15 min,后PBS液(pH值為7.4)洗滌3×5 min;放入3%過氧化氫溶液室溫避光孵育25 min, PBS液(pH值7.4)洗滌3×5 min;滴加3%BSA封閉 30 min;滴加一抗覆蓋組織(用3%BSA按一定比例稀釋),濕盒內(nèi)4℃孵育過夜,PBS液(pH值7.4)洗滌3×5 min;滴加二抗(HRP標(biāo)記)覆蓋組織(與一抗相應(yīng)種屬),室溫孵育50 min,PBS液(pH值7.4)洗滌3×5 min;滴加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下控制顯色時間(陽性為棕黃色),自來水沖洗切片終止顯色;Harris蘇木素復(fù)染約3 min,自來水沖洗;1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,自來水沖洗;氨水返藍(lán),流水沖洗;常規(guī)脫水,晾干,中性樹膠封片;在通風(fēng)廚中放置1～2 h晾干,顯微鏡下觀察、分析。

1.8 圖像分析和統(tǒng)計學(xué)方法

確定SYN、GAP-43免疫反應(yīng)產(chǎn)物的分布。標(biāo)記強度用光密度值(OD值)表示。采用Eclipse Ti-SR光學(xué)顯微鏡觀察SYN及GAP-43切片,采用Image pro-plus 6.0圖像分析軟件分析大鼠大腦右側(cè)皮質(zhì)病灶區(qū)及海馬區(qū)組化圖片,對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值(IOD)。所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用檢驗。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組造模后6 d不同部位SYN IOD值比較

免疫組化染色顯示,SYN陽性物質(zhì)主要見于梗死區(qū)域周圍大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元胞漿、突起及纖維束中,呈棕褐色顆粒狀或點狀(見圖1、圖2)。

由表1可見,模型組和電針組造模后6 d海馬和皮層SYN IOD值與正常組和假手術(shù)組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。電針組造模后6 d海馬和皮層SYN IOD值與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。

表1 各組造模后6 d不同部位SYN IOD值比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.05;與假手術(shù)組比較2)＜0.05; 與模型組比較3)＜0.05

2.2 各組造模后6 d不同部位GAP-43 IOD值比較

梗死周圍皮質(zhì)區(qū)域和海馬均有GAP-43的表達(dá)(見圖3、圖4)。

由表2可見,模型組和電針組造模后6 d海馬和皮層GAP-43 IOD值與正常組和假手術(shù)組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。電針組造模后6 d海馬和皮層GAP-43 IOD值與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。

表2 各組造模后6 d不同部位GAP-43 IOD值比較(±s)

注:與正常組比較1)＜0.05;與假手術(shù)組比較2)＜0.05; 與模型組比較3)＜0.05

注:A為正常組,B為假手術(shù)組,C為模型組,D為電針組

注:A為正常組,B為假手術(shù)組,C為模型組,D為電針組

注:A為正常組,B為假手術(shù)組,C為模型組,D為電針組

注:A為正常組,B為假手術(shù)組,C為模型組,D為電針組

2.3 各組不同時間點Bederson評分比較

由表3可見,模型組和電針組造模后2 h Bederson評分較正常組和假手術(shù)組明顯上升,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05);模型組和電針組造模后6 d Bederson評分均有下降,與正常組和假手術(shù)組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。電針組造模后2 h和造模后6 d Bederson評分與模型組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (＞0.05)。

表3 各組不同時間點Bederson評分比較 (±s,分)

注:與正常組比較1)＜0.05;與假手術(shù)組比較2)＜0.05

3 討論

突觸可塑性是指突觸在形態(tài)和功能上的改變,是神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育損傷修復(fù)及學(xué)習(xí)記憶等活動的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ),在卒中后神經(jīng)功能改善中具有重要作用[11]。本研究所采用的Bederson評分是評估動物腦缺血損傷側(cè)肢體的感覺、運動、反射功能的一種神經(jīng)功能評估方法,主要評估前肢屈曲情況、前肢肌張力、術(shù)側(cè)與手術(shù)對側(cè)肌力及轉(zhuǎn)圈行為。線栓法是制作MCAO/R動物模型的常用方法,通過閉塞實驗動物大腦中動脈,并于90 min后抽離線栓實現(xiàn)腦組織再灌注,造成大腦中動脈所支配區(qū)域腦組織的永久性損傷,故MCAO模型大鼠造模后表現(xiàn)為永久性肢體運動功能障礙。實驗中觀察到造模后6 d模型組、電針組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均有所降低,但仍高于正常組和假手術(shù)組,大鼠肢體仍存在上肢屈曲、轉(zhuǎn)圈行為等神經(jīng)功能缺損表現(xiàn),提示實驗動物肢體功能難以恢復(fù)至損傷前水平。電針組和模型組的評分較造模術(shù)后2 h有明顯減輕的趨勢,提示造模大鼠存在自我修復(fù)能力,而模型組和電針組組間比較無顯著差異,但電針組Bederson評分仍較造模術(shù)后2 h有降低的趨勢。這可能與神經(jīng)功能缺損評分能夠宏觀評估神經(jīng)功能,但難以實現(xiàn)相對精細(xì)定量評估神經(jīng)功能相關(guān)。

SYN是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能均有密切聯(lián)系的磷酸蛋白,其主要存在于神經(jīng)元突觸前囊泡,在突觸囊泡的轉(zhuǎn)運、導(dǎo)入及遞質(zhì)的釋放中發(fā)揮重要作用,是突觸小泡特異性蛋白[12-15]。因此,通過檢測SYN的密度和分布可間接評估突觸數(shù)量的多寡和分布特點,是公認(rèn)的神經(jīng)可塑性的主要標(biāo)記物[16-19]。Stroemer RP等[20]發(fā)現(xiàn)腦缺血損傷后,隨著時間的推移,模型動物術(shù)側(cè)相應(yīng)皮質(zhì)區(qū)域SYN的表達(dá)增加,且神經(jīng)行為功能的改善與SYN的表達(dá)水平呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,腦缺血再灌注后6 d,缺血組、電針組SYN表達(dá)相較對照組和假手術(shù)組顯著變小。這可能是腦缺血后損傷了突觸結(jié)構(gòu),導(dǎo)致突觸前囊泡內(nèi)的SYN低水平,這與既往研究結(jié)果相一致[21]。電針組梗死周圍皮質(zhì)區(qū)域和海馬SYN的表達(dá)明顯高于模型組,提示電針風(fēng)池穴可促進SYN的表達(dá),說明電針可以促進腦缺血性損傷區(qū)神經(jīng)末梢突觸的形成和重構(gòu)。電針改善神經(jīng)功能的作用可能經(jīng)由此機制發(fā)揮,此結(jié)果也與既往的研究相一致[22-25]。

GAP-43是一種廣泛存在于神經(jīng)元軸突內(nèi)的特異性磷酸蛋白,成年后,GAP-43的表達(dá)在大部分腦區(qū)處于較低水平或不表達(dá),在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中或神經(jīng)損傷后,往往出現(xiàn)GAP-43在基因和蛋白水平的表達(dá)或上調(diào),與神經(jīng)可塑性密切相關(guān)[26-29]。國際上將GAP-43作為神經(jīng)元軸突再生的分子標(biāo)志,是神經(jīng)可塑性研究的首選分子探針[30]。既往研究證實,神經(jīng)組織受到損傷、缺血等情況下,機體自身可誘導(dǎo)生長相關(guān)蛋白表達(dá)。當(dāng)腦組織損傷時,誘發(fā)損傷區(qū)域GAP-43水平升高,激活神經(jīng)纖維發(fā)芽、突觸重建等一系列神經(jīng)再生過程,隨著損傷修復(fù)時間的延長,GAP-43表達(dá)逐步回落,直至再生完成[31]。石旺清等[32]發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血再灌注后3 d缺血區(qū)周邊組織神經(jīng)元凋亡達(dá)到高峰,GAP-43表達(dá)增強,7 d達(dá)到高峰,以后逐漸減弱。有研究發(fā)現(xiàn),電針可增加GAP-43的表達(dá)[33]。卿鵬等[34]發(fā)現(xiàn)電針結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練能促進大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)及海馬CA3區(qū)GAP-43的表達(dá),而在針刺方法上,雙側(cè)電針法較患側(cè)電針法能更好地促進局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重塑。劉斐雯等[35]進一步證實,MCAO/R大鼠在電針干預(yù)后海馬區(qū)GAP-43的表達(dá)顯著增加。本研究結(jié)果顯示,電針組與模型組比較,GAP-43表達(dá)明顯增強,提示電針風(fēng)池穴可促進腦缺血損傷后的神經(jīng)元軸突再生。

本研究選用的風(fēng)池穴屬足少陽膽經(jīng)穴,為手少陽經(jīng)、足少陽經(jīng)、陽維脈之會,該穴位于頭部兩側(cè),依據(jù)“腧穴所在,主治所在”,故可以治療腦血管疾病。干預(yù)方法選用電針刺激,相對于單純針刺,刺激參數(shù)易于設(shè)定,刺激量可實現(xiàn)定量控制,維持刺激的一致性,且方便操作[36]。近年來,關(guān)于風(fēng)池穴對中風(fēng)的治療作用已經(jīng)得到證實。張晨茜等[37]研究發(fā)現(xiàn)以風(fēng)池、風(fēng)府為主配合常規(guī)針刺治療缺血性中風(fēng)有較好的治療作用。徐佳等[38]發(fā)現(xiàn)電針雙側(cè)風(fēng)池穴可逆轉(zhuǎn)大鼠大腦缺血側(cè)誘發(fā)電位中Nl波的振幅降低。秦彥強等[39]發(fā)現(xiàn)電針風(fēng)池穴預(yù)處理可提高MCAO模型大鼠缺血性耐受,提高大鼠運動、平衡、學(xué)習(xí)及記憶能力。

綜上所述,單純電針刺激雙側(cè)風(fēng)池穴可顯著上調(diào)GAP-43和SYN的表達(dá)水平,表明電針雙側(cè)風(fēng)池穴對神經(jīng)元功能有一定的調(diào)節(jié)作用,在一定程度上可誘導(dǎo)局灶性缺血再灌注大鼠模型的神經(jīng)軸突再生和突觸功能與結(jié)構(gòu)的重構(gòu),有利于神經(jīng)元的再生,從而促進肢體功能的改善。然其是否與多穴刺激具有等同效應(yīng),還需要以后的進一步研究。

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Effect of Electroacupuncture at Fengchi (GB20) on Synaptophysin and Growth Associated Protein-43 in Rats with Ischemia/Reperfusion Injury

1,-2,-2,3,-4,5.

1.,201508,; 2.,200030,; 3.,200030,; 4.,200437,; 5.,201203,

To study the effect of electroacupuncture at Fengchi (GB20) on the expressions of synaptophysin (SYN) and growth associated protein-43 (GAP-43)in rats with ischemia/reperfusion (I/R) injuryThirty-two male Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into normal, sham operation, model and electroacupuncture groups, with 8 rats in each group. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) rat model was generated by thread embolization in the model and electroacupuncture groups. The electroacupuncture group received electroacupuncture at bilateral Fengchi (GB20), once a day, 30 min each time, until the rats were executed. The expressions of SYN and GAP-43 were examined by immunohistochemistry method.The Bederson scores 2 hours and 6 days after modeling in the model and electroacupuncture groups were significantly different from those in the normal and sham operation groups (＜0.05). The integrated optical density (IOD) values of SYN and GAP-43 in hippocampus and cortex 6 days after modeling in the model and electroacupuncture groups were significantly different from those in the normal and sham operation groups (＜0.05). The IOD values of SYN and GAP-43 in hippocampus and cortex 6 days after modeling in the electroacupuncture group were significantly different from those in the model group (＜0.05).Electroacupuncture at Fengchi (GB20) can promote the expressions of SYN and GAP-43 in rats with I/R injury, which suggests that electroacupuncture can promote axon regeneration and improve synaptic plasticity.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Acupoint, Fengchi (GB20); Cerebral ischemia; Ischemia and reperfusion injury; Synaptophysin; Growth associated protein-43; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.13.0071

1005-0957(2019)13-0071-07

2018-12-03

上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題(201640128);上海市自然科學(xué)基金項目(17ZR1427500)

韓清(1981—),男,住院醫(yī)師,碩士,Email:dada1981xiaoxiao@163.com

徐鳴曙(1978—),男,副研究員,博士,Email:mingshuxu@163.com