豬CAⅢ基因CDS 區(qū)克隆、生物信息學(xué)及組織表達(dá)分析

樂寶玉，張寧芳，成志敏，秦本源，吳怡琦，王媛媛，王鶴潔，蔡春波，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

碳酸酐酶（carbonic anhydrases，CAs）是1932 年從牛血中分離出來的，并確定與血紅蛋白不同，命名為碳酸酐酶[1]，是一種廣泛存在于不同細(xì)胞內(nèi)含鋅的金屬蛋白酶家族[2]，該家族能夠催化CO2的可逆水合反應(yīng)，以維持酸堿平衡[3]。CA 有α，β，γ，δ，ζ，η 和θ 等7 個(gè)家族[1]，所有哺乳動(dòng)物來源的CA 均屬于α 家族，其他家族主要見于植物、藻類、真菌及古細(xì)菌等[4]。α，β，γ 這3 個(gè)家族成員的晶體結(jié)構(gòu)在三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)上完全不同，其結(jié)構(gòu)隨種屬的不同而異，但其活性中心具有高度相似性，在每個(gè)碳酸酐酶的活性中心都結(jié)合了一個(gè)Zn2+[4]。現(xiàn)已確定，人碳酸酐酶總共有15 種亞型，這些同工酶因細(xì)胞定位和催化效率而不同。CAⅠ，CAⅡ，CAⅢ，CAⅦ，CAⅧ，CAⅩ，CAXⅢ是胞漿內(nèi)酶，CAⅣ，CAⅨ，CAXII 和CAXIV 為胞膜相關(guān)蛋白，CAVA 和CAVB 是存在于細(xì)胞線粒體中，CAⅥ是分泌蛋白[1]。碳酸酐酶在多種生理功能中起著重要的作用，如連接代謝組織和肺CO2/HCO3-的呼吸和轉(zhuǎn)運(yùn)，維持胞內(nèi)pH 穩(wěn)定和CO2平衡，參與生物合成反應(yīng)、骨吸收、鈣化和腫瘤形成[2]，也與青光眼、水腫、癲癇、肥胖和癌癥等疾病有關(guān)，因此，其被認(rèn)為是藥物靶標(biāo)[1]。

豬CAⅢ基因位于4 號(hào)染色體4q→q14，有7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子[3]。CAI 和CAⅡ與CAⅢ在碳酸酐酶家族成員中的相似性最高，因?yàn)樗麄儾粌H相對(duì)分子質(zhì)量最接近，而且氨基酸序列也有較高的同源性。CAⅢ和CAⅡ互為同工酶，分子結(jié)構(gòu)上有很多的相似，但它催化CO2水合的活性僅為CAII 的0.3%[5]。CAⅢ是主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白，主要分布于骨骼?。ㄔ诼s骨骼肌纖維中分布非常豐富）、肝臟和脂肪細(xì)胞中，分別約占10%，8% 和24%[6]，此外，CAⅢ在輸尿管平滑肌細(xì)胞、紅細(xì)胞、唾液腺、前列腺、肺、腎、結(jié)腸和睪丸等組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，但表達(dá)量非常低[5]。

CAⅢ在清除胞內(nèi)CO2、調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH、維持組織酸堿平衡、抗氧化、能量代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面均發(fā)揮重要的作用，CAⅢ表達(dá)異常，還可能與多種臨床疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。在一些肝癌細(xì)胞（SK-Hep1）中，CAⅢ能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵入能力，是因?yàn)镃AⅢ改變胞內(nèi)或胞外pH 值激活FAK 信號(hào)通路起作用[7]。CAⅢ是脂肪分化形成的調(diào)節(jié)因子，對(duì)PPARc2 基因的表達(dá)起調(diào)控作用[8]。MITTERBERGER 等[9]研究證實(shí)，在前體脂肪細(xì)胞中降低CAⅢ基因的表達(dá)能促進(jìn)脂肪生成。R?IS?NEN 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物CAⅢ基因可能起到清除氧自由基的作用，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，而SHI 等[11]研究證實(shí)，CAⅢ保護(hù)成熟的骨細(xì)胞免受缺氧和氧化應(yīng)激。GAILLY 等[12]用1 mmol/L H2O2誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞，能顯著增加CAⅢmRNA 的表達(dá)。說明CAⅢ可能是一種多功能酶，存在不同的組織中可能是為了保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。

碳酸酐酶主要通過2 步反應(yīng)催化CO2：第1 步是親核攻擊；第2 步是活性中心Zn2+-OH-的再生水分子自發(fā)脫氫，在轉(zhuǎn)運(yùn)載體下將氫離子從疏水中心運(yùn)出[13]。雖然CAⅢ屬于碳酸酐酶家族，但是對(duì)CAⅢ的生理作用并不了解，CAⅢ與CAI 和CAⅡ同工酶相比，催化二氧化碳水合- 脫水反應(yīng)的活性非常低，主要是因?yàn)榭臻g限制和Lys64 的存在代替His64，這是質(zhì)子快速轉(zhuǎn)運(yùn)出CAII 活性位點(diǎn)的重要?dú)埩粑颷14]，CAⅢ與其他CA 同工酶相比，無論在組織分布還是生理功能上都有其獨(dú)特之處[15]。而關(guān)于CAⅢ的研究主要在鼠和人上，對(duì)豬的研究較少。

本研究克隆豬CAⅢCDS 序列，運(yùn)用生物信息學(xué)進(jìn)行分析，預(yù)測CAⅢ蛋白相關(guān)理化性質(zhì)以及功能，采用qRT-PCR 技術(shù)檢測CAⅢ基因mRNA 表達(dá)譜和時(shí)序表達(dá)規(guī)律，旨在為揭示CAⅢ基因的生物學(xué)功能以及研究其分子遺傳機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 試驗(yàn)動(dòng)物由大同種豬場提供。選擇0，1，2，3，4，5 月齡的大白豬和馬身豬共48 頭，每品種每階段各4 頭，公母各1/2，公豬在28 日齡斷奶時(shí)去勢。在達(dá)到日齡當(dāng)天屠宰，屠宰后采集心臟、肝臟、胰臟、肺、胃、背最長肌、背部皮下脂肪、脾臟、盲腸等9 種組織，放入凍存管，立即投入液氮中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 2×Es Taq MasterMix 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；pMD 18-T Vector，RNAisoTMPlus，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒，DL 1 000 DNA Marker，DH5α，SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；IPTG 及X-Gal 購自依托華茂生物科技有限公司；RNase-Free ddH2O、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；乙醇、異丙醇、氯仿等常規(guī)生化試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA 提取 按照RNAisoTMPlus 方法提取總RNA 后，用1% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用核酸蛋白測定儀（NanoDrop 1000）測定總RNA的純度和濃度，A260/A280值為1.9～2.0，質(zhì)量濃度在1 000 ng/μL 左右，將其稀釋至500 ng/μL，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 引物合成與設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI 中已報(bào)道豬CAⅢ（GenBank：AY789514）和18S rRNA（GenBank：NR_046261）序列，利用Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。

表1 引物序列信息

1.2.3 CAⅢ基因CDS 區(qū)擴(kuò)增和克隆 以1 月齡馬身豬肌肉組織cDNA為模板，擴(kuò)增CAⅢCDS區(qū)。總反應(yīng)體系20 μL：上下游引物各1 μL（10 μmol/L），ddH2O 6 μL，2×Es Taq Master Mix 10 μL，cDNA 模板2 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，將條帶進(jìn)行切膠回收，根據(jù)瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。回收產(chǎn)物用核酸蛋白測定儀（ND1000）檢測濃度?；厥债a(chǎn)物與pMD 18-T Vector 在16 ℃連接30 min，之后轉(zhuǎn)化DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞中，涂于Amp+（含有IPTG 和xgal）平板中，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取白色菌落于Amp+液體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 ～16 h，之后進(jìn)行菌液PCR，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，合格的菌液選1 mL 送華大公司進(jìn)行測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN 軟件將測序結(jié)果進(jìn)行拼接和翻譯；使用在線軟件ExPASy 中的ProtParam 分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，使用ProtScale預(yù)測蛋白質(zhì)疏水性和親水性，使用SignalP 4.1 預(yù)測蛋白質(zhì)信號(hào)肽，使用NetPhos 3.1 Serve 預(yù)測磷酸化位點(diǎn)，使用Psort II 預(yù)測亞細(xì)胞定位，使用Phyre 2.0預(yù)測蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 CAⅢ基因表達(dá)特性分析 以1 月齡馬身豬的9 個(gè)組織以及不同月齡大白豬和馬身豬背最長肌cDNA 為模板，采用qRT-PCR 檢測CAⅢ基因在不同組織中的表達(dá)譜及在不同月齡的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律。反應(yīng)總體積10 μL，包括2×SYBR Premix Ex Taq II 5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）0.3 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.7 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，3min；95 ℃5 s，60 ℃10 s，72 ℃30 s，45 個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s，65 ℃5 s，95 ℃50 s。每個(gè)樣本進(jìn)行3 次重復(fù)，用2-ΔΔCt法對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用GraphPad Prism 7 做圖，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，使用SPSS Statistics 24 軟件進(jìn)行顯著性分析，采用Duncan's 法進(jìn)行多重比較（P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAⅢ基因CDS 擴(kuò)增及克隆測序

采用RT-PCR 擴(kuò)增CAⅢ基因CDS 區(qū)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期目的條帶大小一致（圖1）。經(jīng)克隆測序獲得馬身豬CAⅢ基因的CDS 序列，該序列長783 bp，編碼260 個(gè)氨基酸（圖2）。經(jīng)比對(duì)，本研究獲得的CAⅢ基因編碼序列與NCBI 收 錄 豬CA Ⅲ基 因（GenBank：AY789514.1）CDS 之間的相似度為100%。

2.2 生物信息學(xué)分析

根據(jù)獲得的馬身豬CAⅢ基因CDS 序列，利用DNAMAN 軟件翻譯成蛋白質(zhì)序列（圖2），對(duì)CAⅢ蛋白的理化性質(zhì)及特點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)包含260 個(gè)氨基酸，分子式為C1332H2022N362O378S8，分子量為29 ku，負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp＋Glu）總數(shù)30，帶正電荷氨基酸殘基（Arg＋Lys）總數(shù)31，等電點(diǎn)為7.72，CAⅢ蛋白為堿性蛋白。在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀紅細(xì)胞體外表達(dá)的半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)（II）為33.92，脂肪系數(shù)為73.54，總平均親水性為-0.521。綜上所述，該蛋白為堿性親水性蛋白。

疏水性預(yù)測分析結(jié)果如圖3 所示，CAⅢ蛋白在143 位點(diǎn)有最大值2.744，疏水性最強(qiáng)；在13 和14 位點(diǎn)有最小值2.556，親水性最強(qiáng)，且親水性蛋白多于疏水性蛋白，推測CAⅢ基因編碼的蛋白質(zhì)多肽鏈?zhǔn)怯H水性蛋白，與蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測的結(jié)果一致。對(duì)CAⅢ蛋白的序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測（圖4），得到C 值（剪切位點(diǎn)值）為0.108，Y 值（Y-max是綜合考慮S 值和C 值的一個(gè)參數(shù)）為0.102，S 值為0.121，D 值（S-mean 和Y-max 的平均值）為0.107，CAⅢ蛋白在Y 值曲線沒有出現(xiàn)峰值，S 值＜0.5，說明CAⅢ蛋白很可能不存在信號(hào)肽。蛋白修飾磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，當(dāng)潛在磷酸化位點(diǎn)的閾值為0.5 時(shí)，該位點(diǎn)存在磷酸化位點(diǎn)，則CAⅢ蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)有絲氨酸19 個(gè)位點(diǎn)，蘇氨酸3 個(gè)位點(diǎn)，酪氨酸12 個(gè)位點(diǎn)（圖5）。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，CAⅢ蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)，其次是細(xì)胞核，在過氧化物酶體和線粒體中也有分布（表2），由此推斷，CAⅢ蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)作用。對(duì)CAⅢ蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白α- 螺旋區(qū)域有39 個(gè)氨基酸，占15%；參與形成延伸鏈的氨基酸有68 個(gè)，占26.15%；β- 轉(zhuǎn)角區(qū)域有13 個(gè)氨基酸，占5%；參與形成無規(guī)則卷曲的有140 個(gè)氨基酸，占53.85%（圖6）。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，CAⅢ蛋白由α- 螺旋、β- 轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲等一系列復(fù)雜的過程形成了一個(gè)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)（圖7）。

表2 CAⅢ蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測

2.3 豬CAⅢ基因時(shí)空表達(dá)特性分析

2.3.1 CA Ⅲ基因mRNA 表達(dá)譜分析 采用qRT-PCR 技術(shù)對(duì)1 月齡馬身豬心臟、肝臟、胰臟、肺、胃、背最長肌、皮下脂肪、脾、盲腸等9 個(gè)組織中CAⅢ基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，CAⅢ基因mRNA 在不同組織中均有表達(dá)，其中，在背最長肌中的表達(dá)量最高；其次為胰臟；在肝臟、皮下脂肪、脾臟、肺、盲腸、胃中低表達(dá)（圖8）。

2.3.2 大白豬和馬身豬背最長肌CAⅢ基因mRNA時(shí)序表達(dá) 對(duì)從初生到5 月齡大白豬和馬身豬背最長肌中CAⅢ基因mRNA 的時(shí)序表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大白豬中，CAⅢ基因mRNA 表達(dá)量呈上升—下降—上升—下降的趨勢，初生時(shí)最低，1 月齡時(shí)表達(dá)量升高，2 月齡時(shí)下降，此后表達(dá)量再次上升，到3 月齡時(shí)達(dá)到峰值，之后開始下降。在馬身豬中的表達(dá)規(guī)律和大白豬中基本相似，但在5 月齡時(shí)表達(dá)量最高，極顯著地高于其他各個(gè)階段（P＜0.01）（圖9）。

由圖9 還可知，同一月齡大白豬和馬身豬之間比較，在0，1，2 月齡中大白豬和馬身豬CAⅢmRNA表達(dá)量差異不顯著，而在3 月齡以后2 個(gè)品種CAⅢmRNA 表達(dá)量差異顯著，3 月齡和4 月齡時(shí)，大白豬CAⅢmRNA 表達(dá)量顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）地高于馬身豬，而在5 月齡時(shí)，馬身豬CAⅢmRNA 表達(dá)量極顯著地高于大白豬（P＜0.01）。

3 結(jié)論與討論

本研究成功獲得豬CAⅢ基因CDS 序列，并通過生物信息學(xué)方法對(duì)豬CAⅢ基因編碼的蛋白質(zhì)組成結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性進(jìn)行預(yù)測和分析，結(jié)果表明，該基因CDS 區(qū)783 bp，編碼260 個(gè)氨基酸，是一個(gè)堿性親水蛋白，有34 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)有12 個(gè)。酪氨酸磷酸化在生長因子信號(hào)傳導(dǎo)和增殖中發(fā)揮重要的作用[16]，推測CAⅢ蛋白與細(xì)胞增殖有關(guān)。本試驗(yàn)預(yù)測，CAⅢ蛋白亞細(xì)胞定位主要在細(xì)胞質(zhì)中，而α-CA 家族中CAI，CAII，CAⅢ，CAVII 和CAXⅢ均屬于細(xì)胞質(zhì)酶，預(yù)測結(jié)果與他人研究結(jié)果一致[17]，由此推斷，豬CAⅢ基因編碼的蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。

有研究表明，CAⅢ基因在不同組織中均有表達(dá)，但主要在骨骼肌中表達(dá)，它可以代表8%的慢肌纖維骨骼肌的可溶性蛋白質(zhì)[18]。本研究中，CAⅢ基因在背最長肌中表達(dá)量最高，其次是胰臟，研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。就時(shí)序發(fā)育規(guī)律而言，CAⅢ具有獨(dú)特而復(fù)雜的發(fā)育模式，在發(fā)育的特定階段和整個(gè)成年期的3 種不同的中胚層組織中表達(dá)。骨骼肌中CAⅢ水平并不隨動(dòng)物的性別或胖瘦程度而改變，但會(huì)隨動(dòng)物的發(fā)育而發(fā)生明顯變化[19]。CAⅢ基因表達(dá)的第1 個(gè)位點(diǎn)是發(fā)育中的脊索[20]，胚胎的主要軸向結(jié)構(gòu)[21]，當(dāng)脊索不再是連續(xù)結(jié)構(gòu)時(shí)，CAⅢmRNA 存在于脊椎殘余物中，即每個(gè)椎間盤中心的髓核。CAⅢ表達(dá)的第2 階段是在發(fā)育中的肌肉中，一旦肌肉分化并隨著發(fā)育的進(jìn)行而延伸到所有骨骼肌[20]，就會(huì)通過CAⅢ轉(zhuǎn)錄物限制成熟的I 型慢纖維來細(xì)化差異肌肉塊內(nèi)的表達(dá)[22]，出生后，CAⅢ蛋白在慢肌纖維中高表達(dá)[23]。CARTER 等[24]測定了人胚胎和嬰兒時(shí)期骨骼肌中CAⅢ的表達(dá)量，結(jié)果表明，CAⅢ在11 周的胚胎中低表達(dá)，15 周時(shí)開始升高，相當(dāng)于成人表達(dá)量的10%，20 周為成人表達(dá)量的20%，新生兒的表達(dá)量為成人的1/2。本研究中，在生長前期，隨著年齡的增加，在大白豬和馬身豬中，CAⅢ基因mRNA 的表達(dá)基本呈上升趨勢；在大白豬中，在3 月齡時(shí)CAⅢmRNA 表達(dá)量達(dá)到峰值，而在馬身豬中，在5 月齡達(dá)到峰值，這與CARTER[24]的研究結(jié)果基本一致，也與CAⅢ促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能相一致。DAI 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在SK-Hep1 肝癌細(xì)胞中過表達(dá)CAⅢ可導(dǎo)致細(xì)胞的過度增殖和侵襲力增加，CAⅢ增加可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，這有可能是造成大白豬比馬身豬發(fā)育快的原因之一。

就品種間比較而言，在3 月齡之前，背最長肌中CAⅢmRNA 的表達(dá)在大白豬和馬身豬中無顯著差異；在3 月齡以后，2 個(gè)品種的CAⅢmRNA 表達(dá)量差異顯著，3 月齡和4 月齡時(shí)，大白豬CAⅢmRNA 表達(dá)量顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）地高于馬身豬，而在5 月齡時(shí)，馬身豬CAⅢmRNA表達(dá)量極顯著地高于大白豬（P＜0.01），這可能與CAⅢ基因的表達(dá)特性及大白豬和馬身豬骨骼肌肌纖維類型的組成不同有關(guān)。馬身豬為我國地方豬種，大白豬為引入豬種，二者肌肉組織在肌纖維類型上存在顯著差異，在生長發(fā)育后期，馬身豬骨骼肌中慢肌纖維的比例顯著高于大白豬，而CAⅢ基因主要在慢肌纖維中表達(dá)，這就導(dǎo)致5 月齡時(shí)，馬身豬骨骼肌中CAⅢ基因mRNA 的表達(dá)量顯著高于大白豬，具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。