劉孝文，宮瑞松，劉 真，左 君，趙 晶

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 研究生院，北京 1007302中日友好醫(yī)院手術(shù)麻醉科，北京 1000293中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京 1007304北京醫(yī)院麻醉科，北京 100730

非去極化肌松藥(non-depolarizing neuromuscular blocking agents，NMBAs)如羅庫(kù)溴銨可產(chǎn)生骨骼肌松弛效應(yīng)，是臨床麻醉中輔助氣管插管、充分暴露術(shù)野和機(jī)械通氣的重要藥物，其藥代藥效學(xué)特性受到年齡、體溫以及多種疾病狀態(tài)等諸多因素影響[1- 2]。糖尿病作為一種代謝性疾病，在早期即可損害神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)，并引起突觸后煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)改變[3- 5]。糖尿病這些病理變化可能導(dǎo)致羅庫(kù)溴銨等肌松藥的藥效學(xué)改變，但具體影響尚存在爭(zhēng)議，因此也越來(lái)越得到關(guān)注[6- 11]。近年臨床研究顯示，糖尿病患者羅庫(kù)溴銨起效時(shí)間和作用時(shí)間等時(shí)效參數(shù)指標(biāo)與正常患者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[10]。但另有研究顯示，糖尿病患者應(yīng)用羅庫(kù)溴銨后4個(gè)成串刺激(train-of-four，TOF)的T4/T1比值(TOF ratio，TOFr)恢復(fù)至90%所需時(shí)間明顯延長(zhǎng)，提示糖尿病患者羅庫(kù)溴銨藥效增強(qiáng)[11]。而離體肌肉實(shí)驗(yàn)則證實(shí)，糖尿病導(dǎo)致骨骼肌對(duì)各種非去極化肌松藥敏感性降低，表現(xiàn)為肌顫搐50%有效抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)明顯增高[9]。為明確糖尿病對(duì)NMBAs藥效的具體影響，本研究擬建立糖尿病大鼠模型，進(jìn)行在體肌顫搐張力實(shí)驗(yàn)，按劑量累積法給予羅庫(kù)溴銨，并通過(guò)機(jī)械肌動(dòng)描記法(mechanomyography，MMG)記錄肌松效應(yīng)的時(shí)效參數(shù)，并計(jì)算獲得量效參數(shù)指標(biāo)，從而描述糖尿病病程中羅庫(kù)溴銨誘導(dǎo)的脛前肌肌肉阻滯效應(yīng)的變化。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選取同種系SPF級(jí)成年雄性SD大鼠24只，體重200～250 g，由北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，并由固定培訓(xùn)合格人員進(jìn)行飼養(yǎng)和管理。標(biāo)準(zhǔn)飼料、飲水、墊料等相關(guān)物品均經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和糖尿病組。其中正常對(duì)照組6只，糖尿病組再分為造模后2、4和8周3個(gè)亞組，每亞組各6只。

動(dòng)物模型建立大鼠禁食12 h后，參考文獻(xiàn)方法[9，12]一次性給予腹腔注射鏈脲佐菌素(Sigma公司，美國(guó))60 mg/kg(用0.1 mol/L pH 4.5枸櫞酸緩沖液稀釋)，誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，對(duì)照組則給予檸檬酸鈉緩沖液(北京江晨文軒生物科技公司)進(jìn)行等量注射。給藥72 h后檢測(cè)尾靜脈血糖，血糖≥16.7 mmol/L即為造模成功。如血糖<16.7 mmol/L，則繼續(xù)注射鏈脲佐菌素重新造模。

在體脛前肌張力實(shí)驗(yàn)大鼠稱重，腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥鈉(Merck公司，美國(guó))對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，術(shù)中根據(jù)需要適量追加。將大鼠置于恒溫解剖臺(tái)(北京江晨文軒生物科技公司)，行氣管切開(kāi)，插氣管導(dǎo)管后連接ALC-V8S小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)進(jìn)行機(jī)械通氣，設(shè)定潮氣量為10 ml/kg，頻率55～60 次/min，吸呼比為1∶2，氧流量0.5 L/min。打開(kāi)RM6240型多道生理信號(hào)采集系統(tǒng)(成都儀器廠)，大鼠尾部熱敷后放置尾壓測(cè)定裝置，并行尾靜脈穿刺置管已備輸液或給藥。大鼠右后肢脫毛后剪開(kāi)腹股溝皮膚，用玻璃分針?lè)蛛x暴露坐骨神經(jīng)并放置電極線與神經(jīng)刺激器相連。固定右肢，分離右脛前肌，離斷遠(yuǎn)端肌腱并與肌張力換能器相連。采用連續(xù)TOF刺激右側(cè)坐骨神經(jīng)，具體參數(shù)為電壓2 v，頻率2 Hz，波寬200 μs，刺激間隔10 s[13]。記錄脛前肌張力曲線，并在曲線穩(wěn)定后按劑量累積法靜脈給予羅庫(kù)溴銨[默沙東(中國(guó))有限公司]。羅庫(kù)溴銨初始劑量為0.2 mg/kg，之后以0.1 mg/kg遞增，最大劑量為1.2 mg/kg，均用生理鹽水稀釋至0.5 ml，并在30 s內(nèi)勻速緩慢輸入。TOF的第4個(gè)肌顫搐T4和第1個(gè)肌顫搐相同即T4=T1時(shí)方可給予下一個(gè)劑量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中間斷向暴露處肌肉和神經(jīng)噴灑Krebs液(中科邁晨科技有限公司)，以保持其濕潤(rùn)及活性。同時(shí)恒溫解剖臺(tái)保溫，監(jiān)測(cè)肛溫，避免低體溫出現(xiàn)，并每隔1 h進(jìn)行血?dú)夥治?。?shí)驗(yàn)中肌張力及血壓數(shù)值均由RM6240型多道生理信號(hào)采集系統(tǒng)記錄。

藥效學(xué)指標(biāo)測(cè)定起效時(shí)間：給予肌松藥后到T1產(chǎn)生最大抑制的時(shí)間；TOFr75時(shí)間：從給完肌松藥到TOFr恢復(fù)到75%的時(shí)間；TOFr90時(shí)間：從給完肌松藥到TOFr恢復(fù)到90%的時(shí)間。T1最大肌顫搐抑制：給予肌松藥后，連續(xù)3次T1肌顫搐抑制達(dá)到最大時(shí)的肌張力抑制程度。采用Prism 6軟件(GraphPad公司，美國(guó))，根據(jù)羅庫(kù)溴銨對(duì)數(shù)劑量及最大肌顫搐抑制，采用四參數(shù)模型擬合劑量效應(yīng)曲線，并計(jì)算 IC50及其95%可信區(qū)間[14]。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SAS 9.4軟件(SAS Institute Inc.，美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，時(shí)效參數(shù)指標(biāo)的分析采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，采用Macuchly test進(jìn)行球形檢驗(yàn)，對(duì)于不滿足球形檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用Greenhouse-Geisser校正系數(shù)進(jìn)行校正，進(jìn)行不同劑量與分組的主效應(yīng)及兩者交互的分析，IC50的比較采用t檢驗(yàn)[15]。組間兩兩比較結(jié)果均采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩校正。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Prism 6軟件進(jìn)行圖像處理。

結(jié) 果

一般情況糖尿病組18只大鼠均建模成功并存活。造模2周組大鼠在張力實(shí)驗(yàn)前血糖水平為(24.48±3.88)mmol/L，較對(duì)正常照組(5.85±0.73)mmol/L明顯增高(P<0.001)。隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，糖尿病4和8周大鼠血糖[(23.60±3.88)mmol/L和(25.80±4.09)mmol/L]與造模2周組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外，術(shù)中各組大鼠的血?dú)夥治鼋Y(jié)果、體溫、心率及血壓數(shù)值均在正常范圍，未出現(xiàn)明顯變化。

羅庫(kù)溴銨起效時(shí)間隨著羅庫(kù)溴銨劑量增加，大鼠羅庫(kù)溴銨起效時(shí)間逐漸縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=48.965，P<0.001)。與正常大鼠相比，糖尿病各亞組大鼠的羅庫(kù)溴銨起效時(shí)間均顯著延長(zhǎng)，且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，羅庫(kù)溴銨起效時(shí)間進(jìn)一步隨之延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=92.88，P<0.001)，尚不認(rèn)為不同組別與時(shí)間存在交互效應(yīng)(F=1.72，P=0.078)(表1)。

TOFr75時(shí)間和TOFr90時(shí)間隨著羅庫(kù)溴銨劑量增加，各組大鼠羅庫(kù)溴銨TOFr75時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=890.188，P<0.001)。與正常大鼠相比，糖尿病各亞組大鼠的TOFr75時(shí)間縮短，且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，TOFr75時(shí)間隨之進(jìn)一步縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=112.815，P<0.001)，組別與劑量對(duì)TOFr75的影響存在交互效應(yīng)(F=18.855，P<0.001)(表2)。隨著羅庫(kù)溴銨劑量增加，各組大鼠羅庫(kù)溴銨TOFr90時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=965.192，P<0.001)，與正常大鼠相比，糖尿病各亞組大鼠的TOFr90時(shí)間縮短，且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，TOFr90時(shí)間隨之進(jìn)一步縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=216.753，P<0.001)，組別與劑量對(duì)TOFr90時(shí)間的影響存在交互效應(yīng)(F=22.095，P<0.001)(表3)。

羅庫(kù)溴銨劑量效應(yīng)根據(jù)羅庫(kù)溴銨對(duì)數(shù)濃度和肌顫搐張力抑制水平得到的量效曲線顯示，正常大鼠、糖尿病造模2、4及8周大鼠脛前肌的羅庫(kù)溴銨IC50及95%可信區(qū)間分別為0.37(0.35～0.38)mg/kg、0.44(0.43～0.46)mg/kg、0.59(0.57～0.61)mg/kg和0.64(0.61～0.66)mg/kg。與正常對(duì)照組比較，糖尿病各亞組羅庫(kù)溴銨IC50顯著增加，而且隨著糖尿病造模時(shí)間延長(zhǎng)，羅庫(kù)溴銨IC50進(jìn)一步增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。糖尿病導(dǎo)致羅庫(kù)溴銨的劑量效應(yīng)曲線右移(圖1)。

討 論

本研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法成功建立糖尿病大鼠模型，并通過(guò)在體給予羅庫(kù)溴銨后脛前肌肌顫搐張力變化探究糖尿病對(duì)羅庫(kù)溴銨量效指標(biāo)和時(shí)效參數(shù)的影響。結(jié)果表明糖尿病導(dǎo)致大鼠脛前肌對(duì)非去極化肌松藥羅庫(kù)溴銨的敏感性下降，表現(xiàn)為量效曲線右移，TOFr恢復(fù)75%和90%的時(shí)間均增加，并且隨著病程延長(zhǎng)，羅庫(kù)溴銨敏感性的變化越顯著。

目前，有關(guān)糖尿病對(duì)NMBAs藥效學(xué)影響的研究資料較為有限[6- 11]。Huang等[9]在大鼠離體趾長(zhǎng)伸肌(extensor digitorum longus muscle，EDL)和比目魚(yú)肌(soleus muscle，SOL)肌條中觀察糖尿病對(duì)羅庫(kù)溴銨、順式阿曲庫(kù)銨等NMBAs的藥效學(xué)影響，在離體狀態(tài)下，糖尿病4和16周大鼠EDL和SOL的羅庫(kù)溴銨IC50均較正常大鼠明顯升高，糖尿病16周大鼠EDL和SOL羅庫(kù)溴銨IC50則較糖尿病4周大鼠升高更多，同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)，糖尿病對(duì)NMBAs藥效的影響并不因肌松藥種類變化而改變。但是由于該研究是離體實(shí)驗(yàn)，不能完全代表在體量效指標(biāo)，而且無(wú)法獲得時(shí)效參數(shù)。本研究從在體動(dòng)物水平觀察糖尿病對(duì)羅庫(kù)溴銨量效指標(biāo)的影響，表明糖尿病引起羅庫(kù)溴銨量效曲線右移，與上述離體研究的結(jié)果一致。本研究還進(jìn)一步獲得糖尿病大鼠羅庫(kù)溴銨肌松作用的時(shí)效參數(shù)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，羅庫(kù)溴銨起效時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，TOFr75時(shí)間和TOFr90時(shí)間逐漸縮短，再次驗(yàn)證糖尿病可導(dǎo)致骨骼肌對(duì)羅庫(kù)溴銨敏感性降低。

表1 不同組不同濃度下羅庫(kù)溴銨起效時(shí)間(n=6，-±s，s)Table 1 The onset time of rocuronium at different doses in different groups(n=6，-±s，s)

P1：造模2周組與正常對(duì)照組比較；P2：造模4周組與正常對(duì)照組比較；P3：造模8周組與正常對(duì)照組比較

P1：diabetic 2-week group was compared with normal control group；P2：diabetic 4-week group was compared with normal control group；P3：diabetic 8-week group was compared with normal control group

糖尿病患者NMBAs藥效學(xué)變化的臨床研究結(jié)果存在一些爭(zhēng)議。Saitoh等[6]對(duì)2型糖尿病患者與非糖尿病患者使用維庫(kù)溴銨進(jìn)行對(duì)比觀察，結(jié)果表明維庫(kù)溴銨起效時(shí)間和TOFr恢復(fù)時(shí)間未受糖尿病影響，T1～T4和T1/T0所需的恢復(fù)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，但糖尿病患者所需平均超強(qiáng)刺激電流明顯更高。但Alper等[10]研究顯示糖尿病患者羅庫(kù)溴銨起效時(shí)間、作用時(shí)間、恢復(fù)指數(shù)(T1肌顫搐的幅度由25%恢復(fù)到75%的時(shí)間)與正?；颊卟町悷o(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另有研究顯示糖尿病患者TOFr恢復(fù)至90%所需時(shí)間明顯延長(zhǎng)[11]。綜合目前臨床研究，似乎提示糖尿病可導(dǎo)致患者對(duì)NMBAs敏感性增強(qiáng)，而本研究的結(jié)果與之相反。可能的解釋包括：(1)上述研究的臨床樣本均較小，肌松藥劑量單一，無(wú)法有效排除各種混雜因素的影響。(2)上述研究采用的肌松監(jiān)測(cè)手段都是肌電描記法，而糖尿病可對(duì)肌纖維電流產(chǎn)生影響，肌電描記法監(jiān)測(cè)結(jié)果并不能取代MMG這一金標(biāo)準(zhǔn)來(lái)準(zhǔn)確描述羅庫(kù)溴銨誘導(dǎo)的肌顫搐張力變化情況[16- 17]。而本研究采用均質(zhì)性較高的同源大鼠，給予多個(gè)劑量羅庫(kù)溴銨，并采用MMG方法對(duì)肌顫搐張力變化進(jìn)行描述，可避免一些潛在的混雜影響。

表2 不同組不同濃度下羅庫(kù)溴銨TOFr75時(shí)間(n=6，-±s，s)Table 2 TOFr75 of rocuronium at different doses in different groups(n=6，-±s，s)

TOFr75：從給完肌松藥到4個(gè)成串刺激的T4/T1比值恢復(fù)到75%的時(shí)間；P1：造模2周組與正常對(duì)照組比較；P2：造模4周組與正常對(duì)照組比較；P3：造模8周組與正常對(duì)照組比較

TOFr75：the recovery time from rocuronium injection to train-of-four T4/T1 ratio 75%；P1：diabetic 2-week group was compared with normal control group；P2：diabetic 4-week group was compared with normal control group；P3：diabetic 8-week group was compared with normal control group

糖尿病影響骨骼肌對(duì)羅庫(kù)溴銨敏感性的具體機(jī)制目前尚不清楚，考慮到NMJ是肌松藥直接作用部位，糖尿病對(duì)NMJ的影響可能是造成上述現(xiàn)象的重要因素。有研究表明，在神經(jīng)或肌肉復(fù)合動(dòng)作(compound muscle action potential，CMAP)尚未受影響的糖尿病早期，NMJ即可受累[3- 5，18]。比如，糖尿病造模2周后小鼠即出現(xiàn)骨骼肌突觸后膜nAChR損害[5]，糖尿病6周內(nèi)即可檢測(cè)到終板膜上運(yùn)動(dòng)單元減少[18]。另外，糖尿病小鼠突觸前nAChR對(duì)乙酰膽堿敏感性增強(qiáng)[19- 20]，糖尿病小鼠突觸間隙乙酰膽堿脂酶表達(dá)下降[21]，這些均有可能增強(qiáng)NMJ對(duì)乙酰膽堿的敏感性，進(jìn)而影響非去極化肌松藥的藥效。鑒于糖尿病2周即可引起NMJ病變，而6周內(nèi)對(duì)神經(jīng)末梢和CMAP影響較小，本研究選擇造模2、4和8周進(jìn)行在體研究。然而，糖尿病是否影響突觸后膜上nAChR亞型表達(dá)及其影響非去極化肌松藥藥效作用的具體機(jī)制尚不明確，后續(xù)本課題組將進(jìn)行相關(guān)探索。

表3 不同組不同濃度下羅庫(kù)溴銨TOFr90時(shí)間(n=6，-±s，s)Table 3 TOFr90 of rocuronium at different doses in different groups(n=6，-±s，s)

TOFr90：從給完肌松藥到4個(gè)成串刺激的T4/T1比值恢復(fù)到90%的時(shí)間；P1：造模2周組與正常對(duì)照組比較；P2：造模4周組與正常對(duì)照組比較；P3：造模8周組與正常對(duì)照組比較

TOFr90：the recovery time from rocuronium injection to train-of-four T4/T1 ratio 90%；P1：diabetic 2-week group was compared with normal control group；P2：diabetic 4-week group was compared with normal control group；P3：diabetic 8-week group was compared with normal control group

圖1正常大鼠與糖尿病大鼠羅庫(kù)溴銨量效曲線

Fig1Cumulative dose-response curve of rocuronium in the normal controls and diabetic rats

本研究尚存在一些不足之處。比如，本研究采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠為1型糖尿病模型，并不能完全模擬臨床中常見(jiàn)的2型糖尿病。另外，與離體研究不同，為盡量避免肝腎損傷等靶器官損傷對(duì)時(shí)效參數(shù)的影響，本研究觀察對(duì)象為相對(duì)早期糖尿病大鼠，時(shí)效參數(shù)結(jié)果尚無(wú)法反映疾病晚期情況。

綜上，本研究結(jié)果顯示，糖尿病可導(dǎo)致大鼠骨骼肌對(duì)羅庫(kù)溴銨敏感性降低，表現(xiàn)為量效曲線右移，肌松作用顯著下降，同時(shí)肌松起效時(shí)間延長(zhǎng)，而恢復(fù)時(shí)間縮短。