從線粒體膜穩(wěn)定作用探討線粒體K（MITO-KATP）通道開放劑改善老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注損傷的機制

張海波，李運麗，艾景雪，高瑞，宋志明

一般情況下，缺血再灌注可使心臟器官或組織功能得到恢復(fù)；但有時也會導(dǎo)致心臟器官或組織的功能障礙和嚴重損傷，這種損傷稱為心肌缺血再灌注損傷（MIRI）[1,2]。MIRI是臨床上常見的病癥，多見心臟手術(shù)后[3]。其中年齡是其重要影響因素之一[4]。隨年齡增長，心臟功能降低是導(dǎo)致MIRI加重的主要原因[5]。線粒體K+ATP（MITOKATP）通道保護心臟的調(diào)節(jié)位點，線粒體K+ATP通道的開放可緩解大鼠心肌缺血再灌注損傷[6]。尼可地爾是一種線粒體K+ATP通道開放劑，有抗心絞痛的作用，已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用[7]?？诜峥傻貭柨砂踩行У闹委熤袊说姆€(wěn)定性心絞痛[8]。近年來，尼可地爾因其作為鉀離子通道開放劑，被證實有再灌注的保護作用[9]。但其對改善老年冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┐笫笮募∪毖俟嘧p傷的機制尚不清楚。本研究擬從線粒體膜穩(wěn)定作用，探討線粒體K+ATP通道開放劑尼可地爾改善老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑實驗動物：健康雄性SD老年大鼠（18～20個月）60只，體重為400～600 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。生長溫度為（23±2）℃，環(huán)境濕度為45%～50%，光照時間為每天12 h，自由進食、進水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

主要試劑：尼可地爾粉劑購自日本中外株式會社；心肌線粒體提取試劑盒、CK-MB和LDH檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；羅丹明123購自Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒及ECL發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；線粒體蛋白提取試劑盒購自北京康為生物科技有限公司；p-Cx43抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和β-actin抗體均購自abcom公司；其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及給藥選取30只SPF級健康雄性SD老年大鼠（18～20個月）隨機分為3組：假手術(shù)（Sham）組、模型（Model）組和尼可地爾（Nic）組，每組20只（動物使用證書號）。建立老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注（MI/R）模型，尼可地爾（Nic）組在再灌注之前，股靜脈注射尼可地爾5 mg/kg，假手術(shù)組和模型組注射等量的生理鹽水。

1.2.2 各組大鼠血清中CK-MB和LDH含量的測定3組大鼠在術(shù)后24 h進行腹主動脈取血，在4℃下，3000 rpm離心10 min后，取上清液。血清樣本置于-80℃冰箱中保存，采用試劑盒法測定血清樣本中CK-MB和LDH水平。具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 流式細胞儀測定各組大鼠心肌細胞的線粒體膜電位制備大鼠心肌細胞單細胞懸液。取1×105個細胞，1000 r/min-1離心5 min，PBS洗滌沉淀2次。加入0.5 ml的羅丹明123染色液，充分混勻。將細胞置于37℃培養(yǎng)箱中孵育15 min。孵育結(jié)束后，4℃下600×g離心5 min，PBS洗滌沉淀2次。使用500 μl的PBS緩沖液重懸細胞，使用流式細胞儀測定各組大鼠心肌細胞的線粒體膜電位的變化情況。注：每組20只大鼠進行此實驗，每個指標重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot法檢測各組大鼠心肌組織及心肌細胞線粒體中的蛋白表達實驗結(jié)束后，各組大鼠立即進行斷頭處死。在無菌條件下取各組大鼠的心肌組織，并使用無菌Hank's緩沖液洗滌2次。使用線粒體蛋白提取試劑盒提取小鼠海馬組織線粒體蛋白。采用Western blot檢測心肌組織線粒體中p-Cx43的蛋白表達水平。同時，提取心肌組織蛋白，采用Western blot檢測心肌組織中Bax和Bcl-2的蛋白表達水平。注：每組20只大鼠進行此實驗，每個指標重復(fù)3次。

使用BCA蛋白濃度試劑盒對蛋白進行定量。選取5%的濃縮膠和10%的分離膠，取20 μl蛋白樣品進行上樣，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用10%的脫脂乳粉溶液封閉2 h后，一抗（1:1000）4℃孵育過夜。使用TBST洗膜三次，每次15 min，二抗（1:4000）室溫孵育2 h，用TBST洗膜三次。使用化學(xué)發(fā)光法對蛋白進行顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理本研究中數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件（美國IBM公司）處理；計量資料采用“均數(shù)±標準差”（±s）表示，先進行正態(tài)性檢驗，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)性分布則組間比較采用單因素方差分析或者重復(fù)測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析；P＜0.05代表差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中CK-MB含量的測定如表1所示，與Sham組相比，模型組大鼠血清中CK-MB的含量增加（P＜0.05），說明心肌缺血再灌注會導(dǎo)致心肌細胞損傷；與模型組相比，尼可地爾組大鼠血清中CK-MB的含量下降（P＜0.05），說明尼可地爾有抗心肌缺血的作用。

表1 各組大鼠血清中CK-MB含量的測定（±s）

表1 各組大鼠血清中CK-MB含量的測定（±s）

注：CK-MB：肌酸激酶同工酶；與Sham 組相比，aP＜0.05；與Model組相比，bP＜0.05

組別 例數(shù) CK-MB（U/mg）Sham組 20 84.35±9.05 Model組 20 146.68±14.72a Nic組 20 108.95±12.17b F值 - 29.625 P值 - 0.001

2.2 各組大鼠血清中LDH含量的測定如表2所示，與Sham組相比，模型組大鼠血清中LDH的含量增加（P＜0.05），說明心肌缺血再灌注會導(dǎo)致心肌細胞損傷；與模型組相比，尼可地爾組大鼠血清中LDH的含量下降（P＜0.05），說明尼可地爾有抗心肌缺血的作用。

2.3 各組大鼠心肌細胞線粒體膜電位的變化采用陽離子綠色熒光染料羅丹明123對線粒體的膜電位進行檢測，如表3所示，與Sham組相比，模型組大鼠心肌線粒體膜電位降低（P＜0.05），而尼可地爾組大鼠心肌線粒體膜電位高于模型組（P＜0.05），說明心肌細胞凋亡時會導(dǎo)致線粒體膜電位降低以及功能變化，而線粒體K+ATP（MITO-KATP）通道開放劑尼可地爾可緩解線粒體的損傷情況（表4）。

表2 各組大鼠血清中LDH含量的測定（±s）

表2 各組大鼠血清中LDH含量的測定（±s）

注：LDH：乳酸脫氫酶；與Sham 組相比，aP＜0.05；與Model組相比，bP＜0.05

組別 例數(shù) LDH（U/mg）Sham組 20 184.35±12.53 Model組 20 326.52±24.68a Nic組 20 238.68±18.16b F值 - 35.146 P值 - 0.000

表3 各組大鼠心肌細胞線粒體膜電位的變化（±s）

表3 各組大鼠心肌細胞線粒體膜電位的變化（±s）

注：與Sham 組相比，aP＜0.05；與Model組相比，bP＜0.05

組別 例數(shù) 線粒體膜電位未降低細胞所占百分比（%）Sham組 20 94.42±5.76 Model組 20 46.74±4.98a Nic組 20 61.49±4.32b F值 - 18.035 P值 - 0.001

2.4 各組大鼠心肌細胞線粒體中p-Cx43、Bax和Bcl-2蛋白的變化Western Blot結(jié)果表明，與Sham組相比，模型組大鼠心肌線粒體p-Cx43的蛋白表達下調(diào)，而尼可地爾組大鼠心肌線粒體p-Cx43的蛋白表達高于模型組，說明尼可地爾能夠上調(diào)心肌線粒體p-Cx43的蛋白表達，維持線粒體的穩(wěn)定性。Western Blot結(jié)果表明，與Sham組相比，模型組大鼠心肌組織中Bcl-2的蛋白表達下調(diào)；而尼可地爾組大鼠心肌組織中Bcl-2的蛋白表達上調(diào)，說明線粒體K+ATP通道開放劑尼可地爾可有效抑制心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細胞凋亡。Western Blot結(jié)果表明，與Sham組相比，模型組大鼠心肌組織中Bax蛋白表達上調(diào)；而尼可地爾組大鼠心肌組織中Bax蛋白表達下調(diào)，說明線粒體K（MITO-KATP）通道開放劑尼可地爾可有效抑制心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細胞凋亡（圖1）。

3 結(jié)果

圖1 大鼠心肌細胞線粒體中p-Cx43、Bax和Bcl-2蛋白的變化

表4 各組大鼠心肌細胞線粒體膜電位的變化（±s）

表4 各組大鼠心肌細胞線粒體膜電位的變化（±s）

注：與Sham 組相比，aP＜0.05；與Model組相比，bP＜0.05

組別 例數(shù) p-Cx43蛋白 Bax蛋白 Bcl-2蛋白Cx43的蛋白 20 1388.03±158.031453.59±203.31367.25±60.86 Model組 20 561.88±138.06a882.63±216.91 1097.38±131.72 Nic組 20 990.81±107.05b1025.75±120.24734.25±140.63 F值 - 18.035 15.369 20.152 P值 - 0.001 0.001 0.001

心肌缺血再灌注損傷常發(fā)生于冠狀動脈搭橋術(shù)、急性心肌梗死溶栓術(shù)、體外循環(huán)下心臟直視手術(shù)等心臟手術(shù)后[10]。研究證實心肌線粒體K+ATP開放劑尼可地爾有抗心絞痛的生理功能[11]。研究表明，尼可地爾可以保護缺血后的心肌組織，并使豚鼠心肌細胞的線粒體膜電位發(fā)生去極化[12]。推測其心肌保護機制可能與激活心肌細胞線粒體K+ATP，使線粒體膜電位發(fā)生去極化有關(guān)[13]。因此，本研究通過建立老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注（MI/R）模型，從線粒體膜穩(wěn)定作用，探討線粒體K+ATP通道開放劑改善老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注損傷的機制。當心肌缺血再灌注損傷發(fā)生后，機體會產(chǎn)生大量的氧自由基，導(dǎo)致細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，加重心肌缺血再灌注損傷程度[14]。研究顯示，當心肌梗死發(fā)生后，存活的心肌細胞更容易發(fā)生缺血再灌注損傷。當心肌缺血再灌注后，機體的血清CK-MB和LDH含量會升高[15]。本研究顯示，當老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注后，血清中的CK-MB和LDH含量會升高，而尼可地爾可降低血清中CK-MB和LDH的含量，提示尼可地爾可以減輕心肌缺血再灌注時的過氧化反應(yīng)，提高心肌組織的抗氧化能力。

線粒體K+ATP激活后，會導(dǎo)致K+內(nèi)流，膜電位發(fā)生去極化，并維持線粒體的能量代謝及體積，抑制細胞凋亡，緩解心肌缺血再灌注損傷[16]。因此，線粒體膜電位的變化與心肌缺血再灌注損傷有著密切的關(guān)系[17]。本研究也發(fā)現(xiàn)，當老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注后，會導(dǎo)致心肌線粒體膜電位降低，說明心肌細胞凋亡時會導(dǎo)致線粒體膜電位降低以及功能變化。而線粒體K+ATP通道開放劑尼可地爾可使心肌線粒體膜電位升高，提示尼可地爾可以緩解心肌缺血再灌注導(dǎo)致的線粒體損傷情況。

縫隙連接蛋白43（Cx43）不僅在心肌細胞膜中表達，也在線粒體內(nèi)膜上表達，是哺乳動物心肌的主要縫隙連接蛋白[18]。Cx43有調(diào)節(jié)線粒體對鉀離子通透性的功能[19]。Cx43與線粒體功能的穩(wěn)定性相關(guān)，包括線粒體通透性、線粒體細胞色素c向胞質(zhì)的釋放以及線粒體內(nèi)鈣離子濃度，從而保護心肌組織[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，在老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注后，心肌線粒體中p-Cx43的表達降低，而線粒體K+ATP通道開放劑尼可地爾可上調(diào)p-Cx43的表達，提示尼可地爾的心肌保護機制可能與上調(diào)心肌細胞線粒體p-Cx43的表達有關(guān)。細胞凋亡是受基因調(diào)控的生理過程，也是缺血再灌注損傷發(fā)生過程中的主要表現(xiàn)[23]。其中，促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2與細胞凋亡密切相關(guān)[24]。本研究表明，尼可地爾組大鼠心肌組織中Bcl-2的蛋白表達增強，Bax的蛋白表達減少，提示尼可地爾可能通過抑制心肌細胞的凋亡，從而發(fā)揮保護心肌細胞的作用。

綜上所述，線粒體K+ATP通道開放劑尼可地爾對心肌缺血再灌注損傷有保護作用，其機制可能是通過降低大鼠血清中CK-MB和LDH的含量，提高心肌細胞線粒體膜電位，上調(diào)心肌細胞線粒體p-Cx43蛋白的表達，抑制心肌細胞的凋亡，從而改善老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注損傷。