循環(huán)miR-155/PDCD4水平與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度關(guān)聯(lián)研究

陸振濤，崔四龍，董艷彩

我國(guó)屬于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟?，CAD）的高發(fā)地區(qū)，尤其是對(duì)于60歲以上的老年人群，已成為第一位的死亡原因[1]，如何防治CAD的發(fā)生和發(fā)展是一項(xiàng)長(zhǎng)期且艱巨的任務(wù)。迄今為止，雖然CAD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但是眾多學(xué)者普遍認(rèn)可，冠狀動(dòng)脈（冠脈）斑塊破裂致管腔狹窄或閉塞是引發(fā)急性冠脈事件的主要原因[2]。大量研究證實(shí)，急性冠脈事件的發(fā)生與冠脈狹窄程度密切相關(guān)[3]。因此準(zhǔn)確判斷冠脈病變程度是進(jìn)行個(gè)體化防治CAD的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在急性冠脈事件發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段扮演著十分重要的角色；例如巨噬細(xì)胞分泌的炎性介質(zhì)-程序性死亡因子4（PDCD4）可以激活Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)沉積[4]。因此PDCD4作為一種典型的促炎蛋白，可以抑制多種心血管細(xì)胞的增殖，并與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成密切相關(guān)[5]。另外，鄭華鋒等[6]通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PDCD4是血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-155的重要靶基因，miR-155通過調(diào)節(jié)PDCD4表達(dá)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡過程。因此，本項(xiàng)研究旨在探討外周血CD4+T細(xì)胞miR-155/PDCD4在CAD患者中的表達(dá)情況，以及對(duì)冠脈病變嚴(yán)重程度的潛在診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究人群選取2017年6月至2018年5月因不明原因胸痛于漯河市中心醫(yī)院心內(nèi)科住院并行冠脈造影（CAG）確診為CAD的285例患者，其中男性161例，女性124例，年齡35～84歲，平均年齡為（65.34±10.87）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《冠心病診斷與治療指南（2014版）》關(guān)于CAD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：左冠狀動(dòng)脈的左前降支（LAD）、回旋支（LCX）、右冠（RCA）及其主要分支中至少有1支血管腔狹窄程度≥50 %；②所有患者遵循自愿原則，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的患者；②合并急性腦血管疾病、急/慢性感染、器質(zhì)性心臟病變、嚴(yán)重肝/腎功能不全、惡性腫瘤者；③既往接受過靜脈溶栓、介入、搭橋手術(shù)者。另外，選取同時(shí)期在我院因相同的胸痛癥狀就診，進(jìn)行CAG檢查未發(fā)現(xiàn)結(jié)果異常，心肌酶和心肌肌鈣蛋白檢查呈陰性的50例受試者作為對(duì)照組納入本項(xiàng)研究。其中男性25例，女性25例，年齡為35～80歲，平均年齡為（66.78±12.03）歲。健康對(duì)照組受試對(duì)象排除CAD、高血壓等心血管疾病。該實(shí)驗(yàn)的所有過程均遵從赫爾辛基宣言標(biāo)準(zhǔn)，該研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且在充分告知可能存在的風(fēng)險(xiǎn)后與所有患者簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 CAG由2位介入專家進(jìn)行操作?；颊咴跈z查前，適度放松手腕，自橈骨莖突上2 cm處行穿刺，經(jīng)鞘管注射3000～6000 U肝素，對(duì)左右冠狀動(dòng)脈進(jìn)行全方位拍片檢查，采用DSA圖像處理系統(tǒng)定量分析冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)和狹窄程度。

1.2.2 血液樣本集對(duì)照組受試者體檢時(shí)或患者入院后立即采集外周靜脈全血5 ml置于肝素鈉真空采血管（美國(guó)BD公司）中，4 ℃靜置1～2 h，2000 rpm離心5 min，離心半徑為10 cm；取上清，移至另一RNase-free離心管中，12 000 rpm離心10 min，離心半徑為10 cm；徹底去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于提取總RNA。同時(shí)采集受試對(duì)象外周靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝管中，2 h內(nèi)送檢。所有檢驗(yàn)均由本院檢驗(yàn)科完成。

1.2.3 CD4+T細(xì)胞提取采用Ficoll-Paque密度梯度離心法提取受試對(duì)象外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），嚴(yán)格按照Dynabeads? FlowComp?人CD4淋巴細(xì)胞磁珠分選試劑盒說明書操作分選。對(duì)分選出的CD4+T細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)，取存活率＞90%的CD4+T細(xì)胞備用。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法檢測(cè)miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)量采用TRIzol試劑盒（日本Takara公司）提取CD4+T細(xì)胞總RNA。采用凝膠電泳檢測(cè)RNA分子量；采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。根據(jù)Taqma? MicroRNA reverse transcription kit和Taqman? MicroRNA assay kit試劑盒（日本Takara公司）說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將cDNA保存至-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照三步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以組織cDNA為模板，以小分子U6作為內(nèi)參，將20 μl反應(yīng)體系置于37 ℃恒溫水浴60 min，85 ℃維持5 s，加入去離子水至100 μl，各反應(yīng)孔取2 μl進(jìn)行PCR。冰浴中配制20 μl PCR反應(yīng)體系，95 ℃維持30 s預(yù)變性，95 ℃維持5 s，60 ℃維持30 s，循環(huán)45次。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的資料設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。miR-155引物：F：5'-TGGCCTTGTACCGATTGCTG-3'；R：5'-GCTGCTCTTCCTTTCCTGTGTT -3'）；PDCD4 引物：F：5'-AACTGTGCCAACCAGTCCAA-3'；R：5'-TCTTCTCAAATGCCCTTTCATC-3'）。PCR結(jié)果判斷：根據(jù)使用說明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對(duì)數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。ΔCt=樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（隨機(jī)陰性對(duì)照樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 病變支數(shù)根據(jù)冠脈病變的累積支數(shù)，將患者分為①單支病變組：前降支（LAD）、回旋支（LCX）、右冠脈（RCA）中任1單支血管狹窄≥50 %；②雙支病變組：LAD、LCX、RCA中任意兩單支血管狹窄≥50 %或者左主干（LM）病變；③三支病變組：LAD、LCX、RCA均狹窄，或者LM合并RCA同時(shí)病變。

1.3.2 冠脈狹窄程度根據(jù)CAG檢查結(jié)果，將患者分為①輕度狹窄組：LAD、LCX、RCA中的主支狹窄＜50%；②中度狹窄組：任一主支狹窄≥50%，但＜75%；③重度狹窄組：LM狹窄≥50%和/或任一主支狹窄≥75%。

1.3.3 Gensini評(píng)分[8]采用Gensini評(píng)分系統(tǒng)來評(píng)價(jià)冠狀動(dòng)脈病變程度：1分，狹窄＜25%；2分，25%～50%狹窄；4分：51%～75%狹窄；8分：76%～90%狹窄；16分：91%～99%狹窄；32分，100%狹窄。冠狀動(dòng)脈個(gè)段所占的系數(shù)：LM×5；前降支近、中、遠(yuǎn)段分別×2.5、×1.5、×1；第一及第二對(duì)角支分別×1、×0.5；回旋支近、中、遠(yuǎn)段分別×2.5、×1.5、×1；右冠近段、中段、遠(yuǎn)段、后降支、左室后支分別×1，所有病變得分相加為最后總分。根據(jù)Gensini評(píng)分，0～30分定義為輕度病變，31～60分定義為中度病變，＞60分定義為重度病變。

1.3.4 生化指標(biāo)檢測(cè)采用DXC800全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckman公司）檢測(cè)三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、空腹血糖（FPG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將資料輸入SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理分析，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；所有計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，否則以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示；滿足方差齊性的計(jì)量資料，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，否則采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)；多組間數(shù)據(jù)比較采用One-way ANOVA分析。采用二分類變量logistic回歸模型分析CAD的危險(xiǎn)因素。采用受試者工作特征（ROC）曲線確定各指標(biāo)的診斷價(jià)值，計(jì)算曲線下面積（AUC）。敏感度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%，特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%，Youden's指數(shù)=敏感度（%）+特異度（%）-100%。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異檢驗(yàn)均為雙側(cè)。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試對(duì)象一般臨床資料比較兩組患者年齡、性別組成、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、風(fēng)險(xiǎn)因素、TC、ALT、AST水平基本一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。而與對(duì)照組受試者相比，CAD組患者TG、HDL-C、BUN、SCr、空腹血糖及CD4+T細(xì)胞miR-155、PDCD4 mRNA水平均較高，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表1）。

2.2 二分類Logistic回歸分析CAD發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析擬選擇受試者的基礎(chǔ)臨床資料，以發(fā)生CAD作為因變量（CAD賦值為1，非CAD賦值為0），逐步納入年齡、性別、BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、BUN、SCr、空腹血糖、miR-155、PDCD4 mRNA變量，采用逐步向前回歸模型分析CAD的危險(xiǎn)因素。結(jié)果顯示外周循環(huán)CD4+T細(xì)胞miR-155和PDCD4水平、TG水平、HDL-C水平、空腹血糖水平是影響CAD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）（表2）。

2.3 不同冠脈病變支數(shù)CAD患者miR-155和PDCD4表達(dá)情況比較經(jīng)CAG檢查，112例為單支病變，97例為雙支病變，76例為三支病變，比較三個(gè)亞組CAD患者外周血CD4+T細(xì)胞miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。且病變支數(shù)越多，miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平以及Gensini評(píng)分越高。尤其是三支病變亞組CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平以及Gensini評(píng)分明顯高于其他兩個(gè)亞組患者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表3）。

表1 兩組受試對(duì)象基本臨床資料分析

2.4 不同冠脈狹窄程度CAD患者miR-155和PDCD4表達(dá)情況比較經(jīng)CAG檢查，88例為輕度狹窄，146例為中度狹窄，51例為重度狹窄，比較三個(gè)亞組CAD患者外周血CD4+T細(xì)胞miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。且冠脈狹窄程度越高，miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平以及Gensini評(píng)分越高。尤其是三支病變亞組CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平及Gensini評(píng)分明顯高于其他兩個(gè)亞組患者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表4）。

表2 多因素logistic回歸分析CAD發(fā)病的危險(xiǎn)因素

2.5 不同冠脈病變程度CAD患者miR-155和PDCD4表達(dá)情況比較根據(jù)Gensini評(píng)分系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，125例為輕度病變，87例為中度病變，73例為重度病變，比較三個(gè)亞組CAD患者外周血CD4+T細(xì)胞miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。且病變程度越嚴(yán)重，miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平越高。尤其是重度病變亞組CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平明顯高于其他兩個(gè)亞組患者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表5）。

2.6 ROC曲線分析miR-155/PDCD4對(duì)重度冠脈病變的診斷價(jià)值采用ROC曲線分別分析CAD患者入院當(dāng)日外周循環(huán)血CD4+T細(xì)胞miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平對(duì)73例重度冠脈病變患者的早期診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，miR-155、PDCD4以及miR-155/PDCD4診斷重度病變的AUC均＞0.7（P＜0.05），預(yù)測(cè)價(jià)值較高，（表6、圖1）。

3 討論

CAD是威脅我國(guó)國(guó)民尤其是老年人群生命健康和生活質(zhì)量的重大公共衛(wèi)生安全問題。CAD的發(fā)病因素多樣化，本項(xiàng)研究中，我們初步分析了影響CAD發(fā)生的相關(guān)因素，其中CAD組患者TG、BUN、SCr以及CD4+T細(xì)胞miR-155、PDCD4 mRNA水平均高于健康對(duì)照組，并且經(jīng)多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)miR-155和PDCD4水平、TG水平、空腹血糖水平是影響CAD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。吳舒窈等[9]學(xué)者去年曾對(duì)上海地區(qū)CAD、Scr、TC和血糖水平升高等都是是誘發(fā)CAD的危險(xiǎn)因素。但是由于本項(xiàng)研究的目的并非是對(duì)影響CAD發(fā)病的危險(xiǎn)因素進(jìn)行大型流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，因此納入的對(duì)照組人群數(shù)量較少，而且是選擇因不明原因胸痛而入院就診的非CAD患者作為對(duì)照組，最終并未得出年齡、性別組成、BMI等因素與CAD發(fā)病的關(guān)系，但是卻證實(shí)，外周血CD4+T細(xì)胞miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)量是影響CAD發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表3 不同病變支數(shù)CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平以及Gensini評(píng)分比較（±s）

表3 不同病變支數(shù)CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平以及Gensini評(píng)分比較（±s）

注：PDCD4：程序性死亡因子4；與單支病變亞組比較，aP＜0.05；與雙支病變亞組比較，bP＜0.05

亞組別 n（例） miR-155 PDCD4 mRNA Gensini評(píng)分單支病變 112 1.02±0.18 0.55±0.12 39.65±8.28雙支病變 97 1.63±0.24a 0.68±0.14a 44.59±8.91a三支病變 76 2.14±0.20ab 0.97±0.17ab 57.64±9.62ab F值 - 678.799 201.932 95.396 P值 - 0.000 0.000 0.000

表4 不同病變程度CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表4 不同病變程度CAD患者miR-155和PDCD4 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：PDCD4：程序性死亡因子4；與輕度狹窄亞組比較，aP＜0.05；與中度狹窄亞組比較，bP＜0.05

亞組別 n（例） miR-155 PDCD4 mRNA Gensini評(píng)分輕度狹窄 88 1.47±0.24 0.61±0.17 34.21±9.78中度狹窄 146 1.70±0.21a 0.72±0.14a 47.40±10.64a重度狹窄 51 1.89±0.18ab 0.83±0.15ab 63.78±8.39ab F值 - 66.087 35.331 142.815 P值 - 0.000 0.000 0.000

miR-155位于人類21號(hào)染色體上B-cell Integration Cluster（bic）基因的第三個(gè)外顯子內(nèi)，是參與免疫調(diào)節(jié)、血管炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子。國(guó)外有學(xué)者曾指出，miR-155可促使單核/巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的攝取，以及粘附因子及趨化因子的表達(dá)[10]。另外，國(guó)內(nèi)Qiu等[11]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，在CAD患者外周血單核細(xì)胞及血清中miR-155的表達(dá)高于正常組，且急性心肌梗死患者外周血單核細(xì)胞及血清中miR-155的表達(dá)高于非急性心肌梗死患者，這與我們的研究結(jié)果基本一致。

CAD的發(fā)病機(jī)制一直是心血管領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，但是一直尚未有明確定論；多項(xiàng)研究證實(shí)，由動(dòng)脈粥樣硬化引起的全身慢性炎癥反應(yīng)是CAD重要的發(fā)病基礎(chǔ)之一[12]。有研究顯示，CAD患者可激活CD4+T淋巴細(xì)胞，并促使大量炎癥因子分泌，CD4+T淋巴細(xì)胞尤其是Th1細(xì)胞，是參與不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和破裂的關(guān)鍵因素[13]。而miR-155作為調(diào)控CD4+T淋巴細(xì)胞活化、分化、參與免疫炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因，在CAD發(fā)生、發(fā)展過程中的作用值得研究。除此以外，今年有學(xué)者通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-155可通過正性調(diào)控其靶基因PDCD4，從而過度激活血管炎癥反應(yīng)，加重冠脈粥樣硬化性病變[14]。在本項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞miR-155和PDCD4的表達(dá)量與冠脈病變支數(shù)、冠脈狹窄程度以及冠脈病變嚴(yán)重程度均密切相關(guān)。且隨著冠脈病變程度的加重，CD4+T細(xì)胞miR-155和PDCD4的表達(dá)量逐漸增加。經(jīng)ROC曲線分析，CD4+T細(xì)胞miR-155和PDCD4表達(dá)量可作為早期診斷CAD患者病變嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。

PDCD4是上個(gè)世紀(jì)末由美國(guó)科學(xué)家Shibahara[15]發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的一類基因，包括腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。2014年，蘇強(qiáng)等[16]發(fā)現(xiàn)負(fù)荷劑量瑞舒伐他汀可以通過抑制CD4+T淋巴細(xì)胞PDCD4的表達(dá)，從而降低不穩(wěn)定心絞痛患者心肌的炎性反應(yīng)。葉金善博士也通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，給予PDCD4－/－/ApoE－/－雙敲除小鼠喂養(yǎng)高脂飲食后，與ApoE－/－敲除小鼠相比，其粥樣斑塊的面積縮小，這說明PDCD4具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用[17]。而PDCD4是miR-155下游關(guān)鍵靶基因，通過激活PDCD1信號(hào)通路，進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[18]。

綜上所述，本項(xiàng)研究首次探討了循環(huán)血CD4+T淋巴細(xì)胞miR-155/PDCD4的表達(dá)水平與CAD的發(fā)生以及冠脈病變程度的相關(guān)性，可作為早期診斷重度冠脈病變的潛在分子標(biāo)志物，同時(shí)也為CAD的個(gè)體化治療以及靶向藥物的研發(fā)提供新的方向。