高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞miR-26a/miR-197表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

劉祖霞，張斌，汪偉，張康林，黃軍利，朱小山，楊峰

糖尿?。―M）是現(xiàn)今對(duì)人類生命健康造成威脅的重要疾病之一，糖尿病心肌?。―CM）是一種常見的DM患者主要心臟并發(fā)癥之一，與DM患者心血管疾病的高發(fā)病率和高死亡率相關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，DCM的致病機(jī)制與心肌細(xì)胞凋亡、糖毒性、氧化應(yīng)激等密切相關(guān)[2]。高糖條件可增加氧化應(yīng)激壓力，引起細(xì)胞線粒體膜電位異常，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3]。因此，降低高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡對(duì)于DM的治療具有重要意義。

MicroRNA（miRNA）是生物體內(nèi)的一類非編碼小分子RNA，長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸，可通過與靶mRNA結(jié)合，抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控[4]。在各種組織與器官中miRNA有廣泛表達(dá)，參與多種細(xì)胞生理及病理過程的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)miRNA參與DCM的生理及病理過程，如miR-206[5]、miR-29[6]。miR-26a和miR-197均為microRNA家族成員，H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-26a表達(dá)升高，過表達(dá)miR-26a可促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡[7]。高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-197表達(dá)升高[8]，提示miR-26a和miR-197在DCM發(fā)生發(fā)展中可能有重要作用。因此本研究旨在miR-26a/miR-197表達(dá)抑制對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力和凋亡率的影響及機(jī)制。

1 材料方法

1.1 試劑和儀器胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、葡萄糖均購(gòu)自美國(guó)Gibco；MTT試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒、BCA試劑盒均購(gòu)自上海生工；β-catenin、PCNA、Bax抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用含血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)80%以上生長(zhǎng)密度時(shí)消化傳代。實(shí)驗(yàn)為生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組H9c2心肌細(xì)胞分為6組處理，即低糖組（LG組）：含有5.5 mmol/L的Glu普通培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞；LG+miRcramble組：5.5 mmol/L的Glu處理細(xì)胞后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRcramble；高糖（HG）+miRcramble組：25 mmol/L的Glu處理細(xì)胞后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRcramble；HG+miR-26a inhibitor組：25 mmol/L的Glu處理細(xì)胞后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-26a inhibitor；HG+miR-197 inhibitor組：25 mmol/L的Glu處理細(xì)胞后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-197 inhibitor；HG+miR-26a/miR-197 inhibitor組：25 mmol/L的Glu處理細(xì)胞后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-26a/miR-197 inhibitor。

1.4 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1 h接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的H9c2心肌細(xì)胞于6孔板，接種濃度為3.6×105個(gè)/孔，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%～90%時(shí)轉(zhuǎn)染cramble、miR-26a inhibitor、miR-197 inhibitor，轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000（美國(guó)Invitrogen）的說明采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，用于細(xì)胞增殖、凋亡及蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.5 miR-26a和miR-197的表達(dá)檢測(cè)收集各組培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間的細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，RNA濃度檢測(cè)后逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA。用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)cramble、miR-26a和miR-197及內(nèi)參基因U6引物。引物由上海生工設(shè)計(jì)及合成。以cDNA為模板，采用20 μl的反應(yīng)體系，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，每孔設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。采用2-△△Ct法計(jì)算方法計(jì)算miR-26a和miR-197的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞活力檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞接種于96孔板，接種濃度為105/ml，參照1.3分組處理細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，細(xì)胞處理48 h后收集細(xì)胞，每孔中加MTT溶液（5 mg/mL）10 μl，于37℃孵育4 h，小心吸棄孔內(nèi)的溶液，加入150 μl DMSO溶液在每孔中，震搖15 min，490 nm，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（A值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)收集1.3分組處理至規(guī)定時(shí)間的細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液（105/ml），PBS洗滌細(xì)胞，1×binding buffer重懸細(xì)胞，分別加入250 μg/ml的AnnexinV-FITC和PI各5 ul，混勻后避光反應(yīng)15～20 min，加入1×binding buffer 400 μl，1 h內(nèi)上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 蛋白質(zhì)印跡在處理至規(guī)定時(shí)間的細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，10%的SDS-PAGE分離蛋白樣品（40 μg），蛋白分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，膜用5%的脫脂奶粉封閉2 h，洗膜，4℃孵育1:1000稀釋的一抗（β-catenin、PCNA和Bax抗體）過夜，洗膜，加入1:5000稀釋的二抗，洗膜，ECL顯色，掃描儀掃描膠片，應(yīng)用gel pro 4.0軟件分析目的蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白的灰度值比值，其比值即為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 靶基因預(yù)測(cè)通過TargetScan（http://www.targetscan.org/）等靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)到miR-26a/miR-197與MCL1存在3，-UTR結(jié)合位點(diǎn)。因此，構(gòu)建野生型和突變型的MCL1的3，-UTR熒光素酶報(bào)告載體，分別命名為Wt-MCL1和Mut-MCL1，同時(shí)共轉(zhuǎn)染miR-NC、Wt-MCL1+miR-26a mimics、Wt-MCL1+miR-197 mimics、Mut-MCL1+miR-26a mimics和Mut-MCL1+miR-197 mimics，通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中雙熒光素酶的活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（±s）表示，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞miR-26a和miR-197的表達(dá)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞miR-26a和miR-197的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果（表1～2），與LG組組比較，LG+miRcramble組miR-26a和miR-197的表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），而HG+miRcramble組miR-26a和miR-197的表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）。與HG+miRcramble組比較，HG+miR-26a inhibitor組miR-26a的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），HG+miR-197 inhibitor組miR-197的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

表1 高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞miR-26a的mRNA表達(dá)

表2 高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞miR-197的mRNA表達(dá)

2.2 抑制miR-26a/miR-197表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞活力的影響各組細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果（表3），HG+miRcramble組細(xì)胞活力明顯低于LG組（P＜0.05），而HG+miR-26a inhibitor組和HG+miR-197 inhibitor組的細(xì)胞活力均明顯高于HG+miRcramble組（P＜0.05），低于HG+miR-26a/197 inhibitor組（P＜0.05）。

表3 抑制miR-26a/miR-197表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞活力的影響

2.3 抑制miR-26a/miR-197表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)的各組細(xì)胞凋亡率結(jié)果（圖1、表4），HG+miRcramble組細(xì)胞凋亡率明顯高于LG組（P＜0.05），而HG+miR-26a inhibitor組和HG+miR-197 inhibitor組的細(xì)胞凋亡率均明顯低于HG+miRcramble組（P＜0.05），高于HG+miR-26a/197 inhibitor組（P＜0.05）。

圖1 抑制miR-26a/miR-197表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

表4 抑制miR-26a/miR-197表達(dá)并經(jīng)高糖處理后H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率

2.4 抑制miR-26a/miR-197表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的影響通過Western blotting檢測(cè)抑制miR-26a/miR-197表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin及下游增殖相關(guān)蛋白PCNA和凋亡相關(guān)蛋白Bax的蛋白表達(dá)（圖2、表5），HG+miRcramble組細(xì)胞β-catenin和Bax的蛋白表達(dá)均明顯高于LG組（P＜0.05），PCNA的蛋白表達(dá)明顯低于LG組（P＜0.05），而HG+miR-26a inhibitor組和HG+miR-197 inhibitor組β-catenin和Bax的蛋白表達(dá)均明顯低于HG+miRcramble組（miR-26a inhibitor：P＜0.05；HG+miR-197 inhibitor組：P＜0.05），高于HG+miR-26a/197 inhibitor組（miR-26a inhibitor：P＜0.05；HG+miR-197 inhibitor組：P＜0.05），PCNA蛋白表達(dá)明顯高于HG+miRcramble組（miR-26a inhibitor：P＜0.05；HG+miR-197 inhibitor組：P＜0.05），低于HG+miR-26a/197 inhibitor組（miR-26a inhibitor：P＜0.05；HG+miR-197 inhibitor組：P＜0.05）。

圖2 抑制miR-26a/miR-197表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的影響

表5 抑制miR-26a/miR-197表達(dá)并經(jīng)高糖處理后H9c2心肌細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化

2.5 靶基因預(yù)測(cè)miR-26a/miR-197的mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中MCL1的蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-26a/miR-197的mimics后H9c2心肌細(xì)胞MCL1的蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染miR-26a/miR-197的inhibitor后的H9c2心肌細(xì)胞MCL1的蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。初步證實(shí)miR-26a/miR-197均與MCL1存在靶向關(guān)系。共轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，Wt-MCL1+miR-26a mimics組和Wt-MCL1+miR-197 mimics組的熒光素酶活性均明顯低于miR-NC組（P＜0.05），而Mut-MCL1+miR-26a mimics組和Mut-MCL1+miR-197 mimics組熒光素酶活性與miR-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明MCL1是miR-26a/miR-197的靶基因（圖3，表6～7）。

圖3 miR-26a/miR-197的mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染對(duì)MCL1蛋白表達(dá)的影響

表6 轉(zhuǎn)染miR-26a/miR-197的mimics/inhibitor后H9c2心肌細(xì)胞中MCL1蛋白表達(dá)變化

表7 各組細(xì)胞熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果

3 討論

DCM被認(rèn)為是獨(dú)立于高血壓及一些已知心臟疾病外的一類心肌疾病，其病理變化包括心肌細(xì)胞凋亡率和壞死、心肌肥大、心肌纖維化等，病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[9]。人類基因中miRNAs約占3%，不僅可對(duì)組織器官形成及細(xì)胞的生理過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，還可影響多種疾病的發(fā)生及發(fā)展，近年來發(fā)現(xiàn)miRNA參與包括心肌細(xì)胞凋亡、心肌肥大、心室重塑等多種心血管病的發(fā)病機(jī)制[10,11]。如miRNA-1[12]、miRNA-133[13]在DCM患者表達(dá)增加，miRNA-29[14]在DCM患者表達(dá)降低，均在心血管疾病中發(fā)揮了重要作用。有研究表明miRNA已廣泛應(yīng)用于DCM治療。miR-26a和miR-197均為MicroRNA家族成員之一，在DCM中的研究較少。H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-26a表達(dá)升高，過表達(dá)miR-26a可促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡[7]。高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-197表達(dá)升高[8]。

本研究首先檢測(cè)了高糖作用下的心肌細(xì)胞miR-26a和miR-197的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)二者的mRNA表達(dá)均明顯升高，將miR-26a/miR-197的抑制物轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞，細(xì)胞活力及凋亡率檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-26a和miR-197的抑制物均可促進(jìn)心肌細(xì)胞的活力，降低細(xì)胞凋亡，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-197的抑制物對(duì)細(xì)胞活力及凋亡率作用更明顯。提示miR-26a和miR-197在DCM治療中占據(jù)重要作用。已知miRNA是通過調(diào)控下游的靶基因表達(dá)而行使生物學(xué)功能，MCL1是Bcl-2家族成員之一，與該家族中的促凋亡成員結(jié)合，通過釋放線粒體內(nèi)凋亡誘導(dǎo)因子及改變線粒體通透性，達(dá)到抗凋亡作用[15]。有研究表明，MCL1表達(dá)下調(diào)可對(duì)心肌細(xì)胞凋亡起到抑制作用[16]。miR-29a可通過對(duì)靶基因MCL1的調(diào)控影響心肌細(xì)胞凋亡[17]，靶基因預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)miR-26a和miR-197均與MCL1的3′UTR有結(jié)合位點(diǎn)，通過將miR-26a/miR-197的mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后MCL1表達(dá)檢測(cè)及轉(zhuǎn)染熒光素酶活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MCL1與miR-26a和miR-197均存在靶向關(guān)系，說明miR-26a/miR-197可靶向MCL1影響DCM的發(fā)生發(fā)展。

Wnt信號(hào)通路是一條重要的信號(hào)通路，參與細(xì)胞凋亡和分化、生長(zhǎng)發(fā)育等的調(diào)控，在心臟疾病中發(fā)揮重要作用[18]。大量研究顯示，健康成人心臟中Wnt信號(hào)通路是沉默的，而在多種心血管疾病中被持續(xù)激活，刺激細(xì)胞的凋亡[19,20]。也有研究顯示，抑制Wnt信號(hào)活性可降低細(xì)胞凋亡，改善心功能[21]。PCNA是DNA復(fù)制過程中的一個(gè)必需物質(zhì)，與細(xì)胞增殖有密切關(guān)系，PCNA表達(dá)上調(diào)可對(duì)心肌細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用[22]。Bax為Bcl-2家族成員之一，對(duì)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用，在心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病中Bax表達(dá)均明顯升高，而抑制其表達(dá)可降低心肌細(xì)胞的凋亡[23,24]。本研究結(jié)果顯示，miR-26a和miR-197的抑制物均可下調(diào)Wnt信號(hào)通路β-catenin和Bax表達(dá)，上調(diào)PCNA表達(dá)，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-26a/miR-197的抑制物對(duì)β-catenin、Bax和PCNA表達(dá)影響更明顯。提示miR-26a/miR-197可通過下調(diào)Wnt信號(hào)降低DCM的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-26a/miR-197可通過靶向MCL1促進(jìn)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞活力和降低細(xì)胞凋亡率，機(jī)制可能與抑制Wnt信號(hào)通路有關(guān)。該研究可能為DM的治療提供了的一定的理論基礎(chǔ)，但本研究?jī)H為體外研究，還需做體內(nèi)研究以便進(jìn)一步證實(shí)。