阿托伐他汀對2型糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化、炎性因子及脂聯(lián)素的作用研究

王珣，江巍，張磊，陳緒江，董曙光，張遠(yuǎn)恒

糖尿病心肌病作為常見的糖尿病并發(fā)癥，是引發(fā)心臟意外的主要原因[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病病理過程主要顯示為在長時間高糖刺激作用下，心肌細(xì)胞微環(huán)境出現(xiàn)能量代謝紊亂、炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激激活，并不斷出現(xiàn)心肌纖維化、心肌重構(gòu)，對生命健康存在嚴(yán)重危害[3]。目前，臨床醫(yī)學(xué)針對糖尿病心肌病多以控制血糖及糾正慢性心力衰竭治療為主，但難以明顯控制病情進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體(EGFR)對糖尿病心肌病患者的心肌纖維化發(fā)展存在促進(jìn)作用，將EGFR作為靶點(diǎn)尋找新型藥物治療糖尿病心肌病為臨床研究重點(diǎn)[4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可對炎性反應(yīng)進(jìn)行抑制，改善患者內(nèi)皮功能，減少心血管不良事件發(fā)生率[5]?；诖耍狙芯繉Π⑼蟹ニ?型糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化、炎性因子及脂聯(lián)素的作用進(jìn)行分析，探討其作用機(jī)制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：清潔級的雄性Wistar大鼠60只(3個月齡)，體質(zhì)量180～200 g，由醫(yī)院實驗中心提供，所有大鼠飼養(yǎng)于清潔級動物房中，恒溫(20℃)、恒濕(40%)環(huán)境飼養(yǎng)；(2)試劑與藥物：鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；阿托伐他汀購自輝瑞制藥有限公司；EGFR抗體購自SANTA CRUZE公司；(3)儀器設(shè)備：GA-7型血糖儀(長沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司),OPJ-1B型切片機(jī)(天津天利航空機(jī)電有限公司)，AU2700型全自動生化分析儀(日本OLYMPUS公司)，IX71型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 實驗方法 2018年3月—2018年7月在武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院動物實驗室進(jìn)行實驗。雄性大鼠60只，隨機(jī)選擇20只作為空白對照組(A組)，給予普通飼料喂養(yǎng)30 d，而后經(jīng)腹腔注射體積相同的枸櫞酸緩沖液；余40只大鼠納入研究組，每日給予高糖、高脂肪食物喂養(yǎng)(即于常規(guī)飼料內(nèi)加入20%豬油、10%蔗糖)30 d，而后經(jīng)腹腔注射小劑量STZ(30 mg/kg，溶入濃度為0.1 mol/L的枸櫞酸緩沖液內(nèi))，14 d后大鼠斷尾取血檢測血糖水平，血糖水平≥22 mmol/L即糖尿病大鼠模型成功；在此基礎(chǔ)上將40只大鼠隨機(jī)分成糖尿病模型組(B組)、阿托伐他汀組(C組)各20只；C組大鼠在成模后第2日給予阿托伐他汀20 mg· kg-1·d-1灌胃，持續(xù)治療2個月。而A組、B組大鼠則給予等體積的飲用水進(jìn)行灌胃。

1.3 觀察指標(biāo)與方法 在實驗結(jié)束時(造模后2個月)使大鼠空腹12～14 h，尾部取血3 ml，離心機(jī)離心取上清液待測。

1.3.1 血糖及血脂檢測：采用血糖儀檢測空腹血糖(GLU)水平；全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、脂聯(lián)素，所有操作全部參照試劑盒說明書執(zhí)行，相關(guān)試劑盒均由北京奧維亞生物技術(shù)有限公司提供。

1.3.2 血清、心肌炎性因子檢測：采用放射免疫法檢測血清和心肌白介素-6(IL-6)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)，所有操作全部參照試劑盒說明書執(zhí)行，相關(guān)試劑盒均由碧云天生物技術(shù)研究所提供。

1.3.3 心肌組織檢測：

1.3.3.1 心肌脂聯(lián)素和炎性因子檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測心肌脂聯(lián)素水平，所有操作全部參照試劑盒的說明書執(zhí)行。

1.3.3.2 心肌組織病理學(xué)特點(diǎn) 取出大鼠心臟進(jìn)行固定及脫水、石蠟包埋、切片，以Masson染色，于顯微鏡下對心肌纖維細(xì)胞分布情況進(jìn)行觀察，用圖像分析軟件對心肌間質(zhì)膠原的面積進(jìn)行測定，并對心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)進(jìn)行計算[6]：CVF=視野內(nèi)膠原面積/心肌總面積×100%。

1.3.3.3 心肌組織EGFR蛋白檢測 采用Western Blot法[7]檢測心肌組織內(nèi)EGFR蛋白，即心肌組織蛋白的提取物通過10% SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉12 h，后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗膜3次，再加入一定量的抗EGFR抗體，于37℃環(huán)境下孵育2 h；再經(jīng)PBS溶液沖洗，后加入一定量的二抗，于室溫條件下孵育40 min，經(jīng)PBS沖洗，用ECT顯色曝光，并經(jīng)膠片顯影。參照目的條帶相關(guān)光密度值，對目的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行判定。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠血糖及血脂水平比較 GLU、TC、TG水平比較，B組>C組>A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 3組大鼠的血糖、血脂水平比較

2.2 3組大鼠血清、心肌組織炎性因子比較 大鼠血清、心肌組織IL-6、CRP、TNF-α水平B組>C組>A組(P<0.01)，見表2、3。

表2 3組大鼠血清炎性因子表達(dá)水平比較

表3 3組大鼠心肌炎性因子表達(dá)水平比較

2.3 3組大鼠血清、心肌組織脂聯(lián)素比較 血清脂聯(lián)素水平A組(2.7±0.4)ng/ml>C組(1.2±0.3)ng/ml>B組(0.6±0.2)ng/ml，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q/P=8.164/0.000、14.472/0.000、8.125/0.000)。心肌組織脂聯(lián)素水平A組(1.6±0.2)ng/ml>C組(0.9±0.1)ng/ml>B組(0.5±0.1)ng/ml，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q/P=7.704/0.000、12.346/0.000、6.328/0.000)。

2.4 心肌形態(tài)學(xué)比較 A組心肌纖維未發(fā)生病變，B組大鼠的心肌纖維細(xì)胞顯示為藍(lán)色，增生顯著，且排列紊亂，相互連接形成網(wǎng)狀，C組心肌纖維病變改善明顯；B組CVF(13.3±2.1)%高于C組(8.6±1.7)%高于A組(3.5±0.6)%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q/P=7.425/0.000、9.426/0.000、6.138/0.000)。圖1見封3。

2.5 3組大鼠心肌組織EGFR蛋白表達(dá)水平比較 大鼠心肌組織內(nèi)EGFR蛋白光密度值B組>C組>A組 [(4.2±0.8)>(2.3±0.7)>(1.4±0.4)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q/P=9.126/0.000、10.218/0.000、6.425/0.000)。

3 討 論

近年來，隨著臨床醫(yī)學(xué)深入研究發(fā)現(xiàn)，亞臨床炎性反應(yīng)在糖尿病心肌病發(fā)生、進(jìn)展過程中起到重要作用[8]，而炎性反應(yīng)伴發(fā)大量的細(xì)胞因子、急性時相蛋白釋放，如IL-6、CRP、TNF-α等[9]。研究顯示，CRP為獨(dú)立于三酰甘油、BMI及纖維蛋白原(FG)的重要DM預(yù)測指標(biāo)，而TNF-α多由激活后的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)釋放，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等多數(shù)非免疫細(xì)胞均能釋放TNF-α，且TNF-α能經(jīng)多種途徑誘發(fā)糖尿病，故TNF-α為導(dǎo)致胰島素抵抗的關(guān)鍵致病因子之一[10-11]。

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞釋放的蛋白，具有多種主要的生理功能，如改善糖脂代謝、胰島素抵抗；降低肥胖患者的體質(zhì)量；保護(hù)心肌細(xì)胞[12]；抑制血管細(xì)胞的黏附分子、細(xì)胞間相關(guān)黏附分子在主動脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，阻止動脈粥樣硬化；抑制巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞生長，將成熟巨噬細(xì)胞相關(guān)功能阻斷，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，針對體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞，脂聯(lián)素能發(fā)揮抑制TNF-α表達(dá)、抗凋亡作用，并且相關(guān)研究表明脂聯(lián)素和2型糖尿病、肥胖及胰島素抵抗的產(chǎn)生、進(jìn)展存在密切相關(guān)性，故脂聯(lián)素表達(dá)能作為2型糖尿病心肌病發(fā)生的獨(dú)立危險因素[14-15]。本研究結(jié)果表明，糖尿病模型組大鼠的血清、心肌組織IL-6、CRP、TNF-α水平明顯高于空白對照組大鼠，脂聯(lián)素水平低于空白對照組；但阿托伐他汀組大鼠的血清、心肌組織IL-6、CRP、TNF-α水平明顯低于糖尿病模型組，脂聯(lián)素水平高于糖尿病模型組，提示炎性反應(yīng)與糖尿病心肌病發(fā)生、進(jìn)展存在密切關(guān)系，而阿托伐他汀能減少血清炎性因子釋放，增加脂聯(lián)素表達(dá)，緩解炎性反應(yīng)。同時，本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病模型組大鼠的血糖、血脂水平高于空白對照組，但經(jīng)阿托伐他汀治療后，阿托伐他汀組大鼠的血糖、血脂、心肌纖維組織增生得到顯著改善，故認(rèn)為阿托伐他汀能對2型糖尿病心肌病大鼠的心肌纖維化、血糖、血脂狀況進(jìn)行改善，分析阿托伐他汀可能直接作用于大鼠的心肌組織[16]。

阿托伐他汀作為臨床調(diào)節(jié)血脂的常用他汀類藥物，其藥理機(jī)制主要為對3-羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)的還原酶活性進(jìn)行抑制，使甲羥戊酸的合成減少，進(jìn)而減少血LDL及TC表達(dá)水平。隨著臨床深入研究他汀類藥物發(fā)現(xiàn)，其于臨床防治心肌重構(gòu)、冠心病及房顫等方面發(fā)揮重要作用，分析作用機(jī)制可能為抗炎、抗增殖及抗氧化應(yīng)激[17]。研究顯示，他汀類藥物能對糖尿病心肌病進(jìn)行改善，分析原因可能經(jīng)對心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激進(jìn)行抑制有關(guān)，但缺乏較多研究報道證實。EGFR作為跨膜蛋白受體，能經(jīng)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)準(zhǔn)確地將細(xì)胞外信號快速轉(zhuǎn)送至細(xì)胞內(nèi)，對細(xì)胞增殖存在促進(jìn)作用[18]。有研究證實，EGFR于多種實體腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈高表達(dá)，而于正常的心肌組織內(nèi)亦存在一定表達(dá)，其能將結(jié)締組織生長因子(CTGF)激活，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移及凋亡作用，加快心肌纖維化[19]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病模型組、阿托伐他汀組大鼠心肌EGFR蛋白表達(dá)顯著高于空白對照組，但阿托伐他汀組低于糖尿病模型組；提示EGFR蛋白在2型糖尿病心肌病發(fā)生、進(jìn)展過程中發(fā)揮促進(jìn)作用，應(yīng)用阿托伐他汀治療能改善糖尿病心肌病大鼠的心肌纖維細(xì)胞增殖，其作用靶點(diǎn)可能是EGFR。

綜上所述，阿托伐他汀能有效防治2型糖尿病心肌病大鼠的炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)脂聯(lián)素表達(dá)，緩解心肌纖維化程度，分析原因可能與阿托伐他汀減少心肌組織內(nèi)EGFR蛋白的表達(dá)有關(guān)。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

王珣：設(shè)計研究方案，整理、分析資料，撰寫論文；陳緒江：修改總指導(dǎo)；張遠(yuǎn)恒：提出研究思維，分析數(shù)據(jù)，審批論文；董曙光：收集整理資料，查找參考文獻(xiàn)；江巍、張磊：實施研究過程