溫度、滲透度和pH對反芻動物飼料總可溶氮組成及含量的影響

趙愛民，劉萬成，張義元，李路勝

（1.山東省聊城市畜牧站，山東聊城 252000；2.山東省聊城市畜牧獸醫(yī)局，山東聊城 252000；3.聊城大學農學院，山東聊城 252059）

反芻動物攝取的飼料蛋白質在瘤胃中容易大量降解。正確的估算瘤胃中粗蛋白質降解速率和程度是目前反芻動物蛋白質評價體系中十分必要的。提高蛋白質利用效率，降低反芻動物氮排泄是目前緩解環(huán)境污染的一個重要措施（Dijkstra等，2007）。在目前的蛋白質評價體系中，飼料蛋白質分餾體系都是在此基礎上采用的瘤胃原位技術及在緩沖液和洗滌劑溶液中的溶解度。蛋白質溶解度是決定瘤胃可降解粗蛋白質的重要因素。在康奈爾的凈能蛋白質系統(tǒng)中，通過硼酸鹽緩沖液在pH6.8測定蛋白質溶解度及可溶性蛋白質比例（非蛋白氮和真蛋白（Sniffen等，1992）。該緩沖液的選擇是基于其在長時間存儲下的穩(wěn)定pH和高相關性（瘤胃不溶氮系數(shù)0.92）（Krishnamoorthy等，1982）。然而，溶劑特性會影響提取蛋白的種類和數(shù)量。Kandylis和Nikokyris（1997）研究了蛋白質在3種溶劑中溶解度的關系，當飼料被分類為同一類型的飼料（谷物、植物蛋白原料、動物副產品類），發(fā)現(xiàn)反芻動物蛋白質降解率與3種溶劑溶解度具有很高的線性相關性（r=0.64～0.91）。顯然，瘤胃pH和滲透度不是恒定的，受日糧、攝食方式等影響。食用大量可快速降解的碳水化合物可使奶牛和肉牛瘤胃pH大大低于6.8，可使?jié)B透壓增加到400 mol/L，特別是與大量可溶性灰分相結合時（Giger-Reverdin，2000）。因此，使用單一溶劑，如硼酸磷酸溶液pH在6.8或水，相關假設的可發(fā)酵性參數(shù)似乎不夠準確（Chavan等，2001）。本研究的目的是研究pH、滲透度和溫度對不同反芻動物飼料原料可溶性氮組成及占總氮比例的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗概述 本研究開展2個試驗來評估不同飼料原料氮溶解度。試驗1評估了豆科植物、油類植物、谷物、黑麥草和青貯類等14個原料。溶解溫度為18和38℃，緩沖液pH為6.8和5.0。試驗2在38℃添加下采用4個pH（5.0、5.6、6.2和6.8）以及2個滲透度（300和400 mol/L）評估豆餅、豆粕、豌豆、蠶豆和羽扇豆氮溶解度。各種原料溶解成分及特性見表1。

表1 試驗用溶解成分及特性

1.2 試驗一 氮的溶解度在各不相同溶劑的測定方法：在燒杯下用溶劑從飼料中提取N，連續(xù)攪拌1 h，一式兩份。燒杯放置在恒溫水浴中，孵育后，混合物在3000 g 20℃離心10 min，取上清液，測定殘基中N的絕對含量。參考Chavan等（2001）的方法進行后續(xù)處理與計算。

1.3 試驗二 參考Carbonaro等（2005）的研究方法用SDS-PAGE法分析可溶性蛋白組成及含量。

1.4 統(tǒng)計分析 所有試驗數(shù)據(jù)均采用SAS的一般線性模型進行分析。試驗1中的冷水、熱水、緩沖液為主因素。試驗2分別分析pH，滲透度以及其對各種原料氮溶解度的影響及交互效應。但組間Tukey’s多重比較P＜0.05時說明組間存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 各組原料蛋白質和可溶氮含量分析 由表2可知，不同處理方法對大多數(shù)原料氮溶解度均有顯著影響（P＜0.05）。不溶水浴溫度和緩沖液特性（pH、滲透度）對原料氮溶解度的影響也不一樣。菜粕中總氮含量最小差異接近0.02，燕麥中總氮含量最大差異接近0.36。對于未處理的羽扇豆和谷物原料，總氮差異在0.1。水溶溫度由18℃升高至38℃顯著提高了大多數(shù)原料氮溶解度（P＜0.05）。在同一滲透度條件下（280 mol/L），緩沖液pH由6.8將至5.0時，對大多數(shù)原料氮溶解度具有負面影響，其中顯著影響羽扇豆氮溶解度，使可溶性氮占總氮比例由0.53降低至0.17（P＜0.05），同時也有降低葵花粕和黑麥草氮溶解度的趨勢（P=0.08）。但隨著pH由6.8降低至5.0，青貯黑麥草和青貯玉米氮溶解度顯著升高（P＜ 0.05）。

表2 各種原料蛋白、結構氮、可溶氮含量分析

2.2 不同原料在18℃水溶液孵育后的終pH 由表3可知，在18℃水浴條件下對各種原料終pH的影響存在差異。但溶液pH在18～38℃，對pH無顯著影響（P＞0.05）。對于烘干原料，終pH較初始值低，在5.6～6.4，而青貯原料的pH都低于5.0，但使用緩沖液后對上述pH無顯著影響（P ＞ 0.05）。

表3 不同原料在18℃水溶液孵育后的終pH

2.3 38℃溶解pH和滲透度對可溶氮占總氮比例的影響 由表4可知，不同滲透度和pH均顯著影響氮溶解度（P＜0.05）。pH由6.8降至5.0時，蠶豆、羽扇豆、豌豆和豆餅可溶氮占總氮比例由0.48降低至0.22。當pH由6.2降至5.6時，顯著降低了上述原料氮溶解度（P＜0.05）。豆粕中氮溶解度在所有原料中表現(xiàn)最低，pH對其影響和上述原料結果一致。滲透度對原料氮溶解度的影響程度小于pH。滲透度由300升高至400 mol/L時，豆粕和豆餅氮溶解度顯著升高（P＜0.05），同時滲透度和pH對其他原料氮溶解度的影響具有顯著交互作用（P＜0.05）。

2.4 400 mol/L滲透度不同pH溶解對非蛋白氮占總氮比例的影響 由表5可知，在同一滲透度條件下，pH由6.2降至5.0時對非蛋白氮占總氮比例無顯著影響（P＞0.05），但有降低豌豆非蛋白氮比例的趨勢（P=0.06）。

2.5 不同pH SDS溶解對不同可溶蛋白結構的影響 由表6可知，溶解pH對豆餅、豌豆、蠶豆和羽扇豆蛋白結構具有顯著影響（P＜0.05），其中pH為6.2～6.8時，7S和11S蛋白比例最高，而11S可溶氮含量降低，除了豌豆外，pH對7S蛋白含量無顯著影響（P＞0.05）。羽扇豆、豌豆和豆餅中2S蛋白比例在pH6.8～5.0由0.07升高至0.22。

3 討論

研究表明，飼料的N溶解度取決于溶劑特性，特別是其pH，對于大多數(shù)飼料，N溶解度隨著pH降低而降低，而這個pH范圍通常是瘤胃的生理pH。pH對未經處理的豆科植物（羽扇豆、豆餅、豌豆和蠶豆）影響最大，它們含有大量可溶性蛋白質。對于這些飼料原料，可溶性氮占總氮的比例從 0.48（pH6.8）下降到 0.22（pH5.0）。作者推測，這種溶解性的降低是由于多肽之間的吸引力增加（等電點）導致蛋白質沉淀。pH為6.2～6.8，7S和11S蛋白比例最高，而11S可溶氮含量降低，除了豌豆外，pH對7S蛋白含量無顯著影響，這與Yoshie-Stark等（2004）研究結果一致。球蛋白溶解度的降低導致了可溶性氮的結構發(fā)生變化，由于pH對非蛋白氮和2S球蛋白溶解度無顯著影響，因此，大多數(shù)可溶性氮成分集中在pH5.0～5.6這個范圍。

表4 38℃溶解pH和滲透度對可溶氮占總氮比例的影響

表5 400 mol/L滲透度不同pH溶解對非蛋白氮占總氮比例的影響

表6 不同pH SDS溶解對不同可溶蛋白結構的影響

滲透度對氮溶解度的影響不太明顯，而且也取決于pH水平。對于蠶豆，較低的pH（5.6和6.2），滲透度由300變?yōu)?00 mol/L，增加了氮溶解度，但pH=6.8時得到了相反結果。這一結果與Carbonaro（2006）報道的存在差異，在其研究中滲透度的差異更大。與其他豆科植物相比，pH和滲透度對豆餅氮溶解度的影響無顯著交互效應，而對于豆粕，隨著滲透度的提高氮的溶解度相應增加。

對于青貯植物，隨著緩沖液pH的降低，氮溶解度反而顯著升高，這可能與樣品中可溶氮結構和含量不同有關。此外，植物發(fā)酵后，可溶性氮組分僅含有少量的真蛋白，因此，對pH的敏感性不如其他飼料（Gierus等，2005）。青貯樣品通常被切成1cm，而不是被磨碎，其細胞壁比磨碎的飼料更完整。一部分可溶的氮組分仍然在細胞結構中，但細胞中可溶性氮組分的釋放與pH之間的關系還有待進一步研究。飼料成分在水中的氮溶解度與飼料中氮溶解度之間不存在相關性。這種相關性的缺失可能是由于在水孵育過程中pH降低所致，主要是因為水缺乏緩沖能力造成的。然而，pH變化幅度取決于飼料的化學成分，如青貯飼料中存在酸。Giger-Reverdin等（2000）也觀察到添加原料后會降低瘤胃最終pH。

由于忽略了pH對未經熟化豆科植物氮溶解度的影響，會高估瘤胃對氮的降解效率。為了避免這個問題可以考慮以下幾點，一是選擇用于測定氮溶解度的溶劑，普通水主要缺點是缺乏緩沖能力，這意味著原料中氮的溶解度可以在不同pH下測量，也可能在不同的滲透度水平下測量（Sadeghi等，2006）。這些差異動物自身并不能感受，同時瘤胃液體積越大，其緩沖能力越強。對于可溶性氮含量較低的飼料（豆粕和啤酒糟）或含大量非蛋白氮的干草，其氮溶解度低。在產乳動物身上，瘤胃pH遠低于6.8，本研究結果表明，對于可溶性真蛋白含量較高的飼料，氮溶解度很大程度上受pH影響。因此，在奶牛營養(yǎng)方面，測定瘤胃pH下的氮溶解度，即緩沖溶液的pH為范圍為5.6～6.2。在肉牛中，瘤胃pH很大程度上取決于飼養(yǎng)系統(tǒng)，因此，高比例牧草和谷物的飼養(yǎng)系統(tǒng)，瘤胃pH可達6.8或更高，而飼喂顆粒料，瘤胃pH在較長時間內均可降至5.6以下（Beauchemin和 McGinn，2005）。

4 結論

溶解pH由6.8降至5.0時（瘤胃pH值生理范圍）降低了大多數(shù)飼料原料氮溶解度。這個pH范圍顯著提高了羽扇豆、蠶豆、豌豆和豆餅非蛋白氮比例，降低了11S蛋白比例。滲透度對原料氮溶解度的影響小于pH。