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    啤酒糟制備低聚木糖功能飼料添加劑酶解條件優(yōu)化

    2019-06-18 06:48:54鄧元元陳思宇朱文娟蘭時(shí)樂
    中國飼料 2019年9期
    關(guān)鍵詞:等高線圖木糖聚糖

    鄧元元, 胡 超, 陳思宇, 朱文娟, 王 剛, 蘭時(shí)樂

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙410128)

    啤酒糟含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)以及鈣、磷、鐵、銅、錳礦物質(zhì)元素 (肖連東等,2008;Mussato等,2005)。近年來,在用啤酒糟代替部分棉籽殼、麥麩栽培食用菌(葉春苗,2016、2015)及發(fā)酵啤酒糟替代豆粕進(jìn)行水產(chǎn)(李小霞等,2016)、肉鵝(姬向波等,2015)、肉鴨(王彥茹等,2016)、育肥奶公牛養(yǎng)殖(周永平,2016)等方面開展了大量的研究,并取得了一定的研究成果,但由于啤酒糟中纖維素含量較高,且容易腐敗,限制了其在飼料工業(yè)中應(yīng)用。

    低聚木糖是一種具有獨(dú)特生理活性的功能性低聚糖,能促進(jìn)動物腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸菌大量增殖(Zhao等,2015),抑制腐敗菌的生長,增強(qiáng)機(jī)體免疫力 (范程瑞等,2017;王曉華,2015)。同時(shí),低聚木糖還具有清除體內(nèi)自由基、抗衰老的功效 (Bian 等,2013;Ayyappan Appukuttan Aachary等,2011)。據(jù)測定,啤酒糟中半纖維素含量為 21.01% ~31.5%(劉甜甜,2013;鄧啟華等,2008),在適宜的工藝條件下可降解成低聚木糖。因此,本試驗(yàn)以啤酒糟為原料,利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化啤酒糟酶解制備含低聚木糖啤酒糟飼料添加劑的試驗(yàn)參數(shù),以期為啤酒糟的深度開發(fā)提供技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 啤酒糟 將購于英博雪津湖南(白沙)啤酒有限公司新鮮啤酒糟置于80℃恒溫條件下烘干至恒重,粉碎至60~80目。

    1.1.2 主要試劑 木二糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%),木三糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%),木四糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度97%),木五糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度96%),購于青島博智匯力生物科技有限公司;碳酸鈉、雙氧水、氫氧化鈣、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇(AR,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙腈(色譜純,美國,Merck 公司);高純氮(純度99%,長沙高科技?xì)怏w有限公司);纖維素酶、木聚糖酶(湖南利爾康生物股份有限公司。其中纖維素酶10000 U/g,木聚糖酶 100000 U/g)。

    1.1.3 主要儀器 色譜柱:COSMOSIL Sugar-D糖分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,北京英萊克科技發(fā)展有限公司);高效液相色譜儀(Agilent 1260,美國,WATERS);蒸發(fā)光散色檢測器(ELSD,美國,WATERS);電子分析天平(KF3102,浙江凱豐集團(tuán)有限公司);高速冷凍離心機(jī)(CR21G,無錫凱派克斯科技有限公司)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 啤酒糟的預(yù)處理 稱取100 g粉碎的啤酒糟,用自來水調(diào)節(jié)固液比為1∶5,按質(zhì)量比加入0.7%的碳酸鈉和0.1%的雙氧水,在115℃條件下處理30 min。

    1.2.2 酶解條件篩選 采用單因素試驗(yàn)研究酶種類、酶添加量、酶解初始pH、酶解溫度、酶解時(shí)間等對低聚木糖產(chǎn)量的影響。

    1.2.3 啤酒糟酶解工藝條件響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,采用Design-Expert.8.0.6b軟件,根據(jù)BOX-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理(王永菲等,2005),選取起始pH、木聚糖酶量、纖維素酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間等條件對低聚木糖含量影響較大的因素,進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。響應(yīng)面設(shè)計(jì)見表1。

    表1 響應(yīng)面因素水平編碼表

    1.2.4 低聚木糖產(chǎn)量的測定 稱取適量的經(jīng)酶解且80℃干燥后的啤酒糟,加入10倍體積的蒸餾水,30℃,180 r/min條件下振蕩提取 30 min,4000 r/min、4℃條件下離心15 min,收集上清液并定容至100 mL,采用HPLC-ELSD法測定啤酒糟中低聚木糖的含量。HLPC-ELSD法測定條件為:色譜柱:COSMOSIL Sugar-D糖分析柱 (250mm×4.6mm,5 μm); 流動相為乙腈-水(69:31,V/V);流速:0.9 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣體積:3 μL;蒸發(fā)溫度:78℃;載氣流速:1.6L/min;載氣壓力:0.5MP。

    表2 纖維素酶添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響

    表3 木聚糖酶添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響

    表4 混合酶對低聚木糖產(chǎn)量的影響

    2 結(jié)果與分析

    2.1 纖維素酶添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響按底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在經(jīng)預(yù)處理的啤酒糟中加入100、150、200、250、300、350 U/g 的纖維素酶,攪拌均勻,45℃、pH 5.0條件下酶解2.5 h,測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結(jié)果見表2。

    從表2結(jié)果可知,隨著纖維素酶添加量的增加,低聚木糖產(chǎn)量也隨之增加。當(dāng)纖維素酶添加量為300 U/g時(shí),低聚木糖產(chǎn)量最高,為18.8721 mg/g。但纖維素酶添加量繼續(xù)增加,低聚木糖產(chǎn)量反而下降。由于纖維素酶添加量為250 U/g和300 U/g時(shí),低聚木糖產(chǎn)量差異不顯著,故選擇纖維素酶的添加量為250 U/g進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

    2.2 木聚糖酶添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響在經(jīng)過預(yù)處理的啤酒糟中按底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別加入 100、150、200、250、300、350 U/g 的木聚糖酶,攪拌均勻,50℃、pH 4.8條件下酶解3 h,測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結(jié)果見表3。

    從表3結(jié)果可知,當(dāng)木聚糖酶添加量為200 U/g時(shí),低聚木糖產(chǎn)量達(dá)19.1448 mg/g。隨著木聚糖酶添加量的增加,低聚木糖產(chǎn)量下降。

    2.3 混合酶對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在經(jīng)過預(yù)處理的啤酒糟中分別加入由纖維素酶和木聚糖酶組成的混合酶,攪拌均勻,50℃、pH 5.0條件下酶解3 h,測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結(jié)果見表4。

    表4結(jié)果表明,不同木聚糖酶和纖維素酶混合酶處理啤酒糟,低聚木糖產(chǎn)量差異較大。 當(dāng)纖維素酶和木聚糖酶以250 U/g和200 U/g組成混合酶時(shí),低聚木糖產(chǎn)量最高,為21.1002 mg/g。

    2.4 起始pH對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在混合酶試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,分別調(diào)節(jié)預(yù)處理后的啤酒糟pH 分別為 3.5、4.0、4.5、 5.0、5.5、6.0,50 ℃條件下酶解3 h,測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結(jié)果見表5。

    由表5結(jié)果可知,在一定范圍內(nèi),隨著預(yù)處理后的啤酒糟初始pH的升高,低聚木糖的產(chǎn)量也隨之增加。當(dāng)初始pH為5.5時(shí),低聚木糖產(chǎn)量達(dá)20.8721 mg/g。

    2.5 酶解溫度對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,分別將酶解溫度設(shè)置為35、40、45、50、55、60℃,酶解3 h后測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結(jié)果見表6。

    溫度是影響酶解效果的主要因素之一。酶促反應(yīng)速度在一定溫度范圍內(nèi)隨溫度的增高而加快,但當(dāng)酶解溫度超過最適酶解溫度,酶促反應(yīng)速率下降。從表6可以看出,當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí),低聚木糖產(chǎn)量最大,為22.4692 mg/g。

    2.6 酶解時(shí)間對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,將預(yù)處理后的啤酒糟分別酶解1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h 后測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結(jié)果見表7。

    由表7結(jié)果可知,隨著酶解時(shí)間的延長,低聚木糖產(chǎn)量也隨之提高。當(dāng)酶解時(shí)間為3 h時(shí),低聚木糖產(chǎn)量達(dá)到22.5649 mg/g;但酶解時(shí)間延長,低聚木糖產(chǎn)量下降。原因可能為隨著酶解時(shí)間的延長,低聚木糖進(jìn)一步被水解成木糖。

    2.7 酶解工藝條件響應(yīng)面優(yōu)化

    2.7.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取酶解工藝中低聚木糖產(chǎn)量影響較大的5個(gè)因素,即起始pH、木聚糖酶酶量、纖維素酶酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間,采用Design-Expert.8.0.6b軟件,根據(jù)BOX-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,對酶解工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表8。

    根據(jù)表8 BOX-Benhnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果,采用Design-Expert.8.0.6b軟件對結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果見表9。

    由表9結(jié)果可知,pH、纖維素酶添加量、木聚糖酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間均是顯著影響低聚木糖產(chǎn)量的主要因素。BC、BE、DE的P值均小于0.05,說明木聚糖酶添加量和纖維素酶添加量、木聚糖酶添加量和酶解溫度、酶解溫度和酶解時(shí)間之間的交互作用顯著。

    采用Design-Expert.8.0.6b軟件對結(jié)果進(jìn)行可信度分析,結(jié)果如表10。

    方差分析結(jié)果表明(表9和表10),模型的F值和失擬項(xiàng)分別為20.78和2.25,P值<0.0001和失擬項(xiàng)較高(0.1463>0.05),說明模型與實(shí)際情況擬合度良好。

    根據(jù)響應(yīng)面系數(shù)的回歸分析,獲得該模型擬合方程為:Y=23.44-0.72A-0.045B-0.25C-1.26D+0.40E-0.39AB+0.48AC-0.63AD+1.11AE-1.45BC+0.66BD+0.90BE-0.35CD+0.64CE+0.72DE-1.59A2-1.73B2-2.19C2-3.17D2-2.14E2。

    該回歸方程的 R2=0.9433,RAdj2=0.8979,CV/%=3.33%,SNR=17.318,說明模型可信度較高,且方程具有較高的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2.7.2 響應(yīng)面分析 基于上述回歸方程,繪制起始pH,木聚糖酶酶量,纖維素酶酶量,酶解溫度,酶解時(shí)間之間交互作用的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖。結(jié)果分別見圖1~圖10。

    表5 初始pH對低聚木糖產(chǎn)量的影響

    表6 酶解溫度對低聚木糖產(chǎn)量的影響

    表7 酶解時(shí)間對低聚木糖產(chǎn)量的影響

    表8 BOX-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    表9 響應(yīng)面結(jié)果方差分析

    表10 二次回歸方程的方差分析

    等高線的形狀可以反映出因素之間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,圓形表示兩因素不顯著,而橢圓則表示較為顯著(毋銳琴等,2008)。由圖1可以看出,隨著木聚糖添加量的增加和pH提高,低聚木糖產(chǎn)量先緩慢增加后緩慢下降,且等高線呈圓形,說明木聚糖酶添加量與pH之間交互作用不顯著。當(dāng)木聚糖酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間處于最佳水平時(shí),纖維素酶添加量與初始pH的交互作用見圖2。由圖2可以看出,隨著纖維素酶添加量的增加和初始pH的提高,低聚木糖產(chǎn)量先上升后下降,說明纖維素酶添加量與初始pH之間存在顯著的交互作用。當(dāng)木聚糖酶添加量、纖維素酶添加量和酶解時(shí)間處于最佳水平時(shí),起始pH與酶解溫度的交互作用見圖3。從圖3可以看出,隨著起始pH與酶解溫度的提高,低聚木糖產(chǎn)量呈先上升后下降,且酶解溫度超過51℃時(shí),低聚木糖產(chǎn)量迅速下降,說明二者對低聚木糖產(chǎn)量有極顯著的影響。當(dāng)木聚糖酶添加量、纖維素酶添加量和酶解溫度處于最佳水平時(shí),初始pH與酶解時(shí)間的交互作用見圖4。由圖4可知,隨著初始pH的升高,低聚木糖產(chǎn)量下降明顯;而低聚木糖產(chǎn)量隨酶解時(shí)間的延長而增加,但酶解時(shí)間超過3.3 h,產(chǎn)量下降,說明二者存在較為顯著的交互作用。當(dāng)初始pH、酶解溫度和酶解時(shí)間處于最佳水平時(shí),纖維素酶添加量和木聚糖酶添加量的交互作用見圖5。由圖5可知,低聚木糖產(chǎn)量隨兩種酶添加量的增加而增加,但當(dāng)纖維素酶添加量和木聚糖酶添加量分別接近350 U/g和250 U/g,低聚木糖產(chǎn)量有所下降,說明兩種酶對低聚木糖產(chǎn)量有顯著的影響。當(dāng)初始pH、纖維素酶添加量和酶解時(shí)間處于最佳水平時(shí),木聚糖酶添加量與酶解溫度的交互作用見圖6。圖6結(jié)果表明,隨著酶解溫度的升高,低聚木糖產(chǎn)量先升后降,而低聚木糖產(chǎn)量隨木聚糖酶添加量的增加先略升后略降,且等高線形狀呈橢圓,說明兩者之間的交互作用顯著。當(dāng)初始pH、纖維素酶添加量和酶解溫度處于最佳水平時(shí),木聚糖酶添加量和酶解時(shí)間的交互作用見圖7。從圖7可知,隨著木聚糖酶添加量的增加和酶解時(shí)間的延長,低聚木糖產(chǎn)量先上升后下降,說明維素酶添加量和酶解溫度存在顯著的交互作用。當(dāng)初始pH、木聚糖酶添加量和酶解時(shí)間處于最佳水平時(shí),纖維素酶添加量與酶解溫度的交互作用見圖8。由圖8可知,低聚木糖產(chǎn)量隨纖維素酶添加量增加與酶解溫度的升高先升高后下降,說明二者對低聚木糖產(chǎn)量有顯著影響,二者交互作用形成的曲面為拋物面,也說明纖維素酶添加量與酶解溫度存在交互作用。當(dāng)初始pH、木聚糖酶添加量和酶解溫度處于最佳水平時(shí),纖維素酶添加量與酶解時(shí)間的交互作用見圖9。圖9結(jié)果表明,低聚木糖產(chǎn)量隨纖維素酶添加量的增加和酶解時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢,說明二者對低聚木糖產(chǎn)量有顯著影響。當(dāng)初始pH、木聚糖酶添加量和纖維素酶添加量處于最佳水平時(shí),酶解溫度和酶解時(shí)間的交互作用見圖10。由圖10可以看出,酶解溫度和酶解時(shí)間交互作用顯著。

    圖1 起始pH與木聚糖酶酶量對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

    圖2 起始pH與纖維素酶酶量對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

    圖3 起始pH與酶解溫度對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

    圖4 起始pH與酶解時(shí)間對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

    圖5 木聚糖酶酶量與纖維素酶酶量對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

    圖6 木聚糖酶酶量與酶解溫度對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

    圖7 木聚糖酶酶量與酶解時(shí)間對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

    圖8 纖維素酶酶量與酶解溫度對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

    圖9 纖維素酶酶量與酶解時(shí)間對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

    圖10 酶解溫度與酶解時(shí)間對低聚木糖含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

    由Design-Expert.8.0.5b軟件可求出回歸模型極值點(diǎn),即適宜酶解條件:起始pH 5.4917,木聚糖酶添加量201.2607 U/g,纖維素酶添加量248.6930 U/g,酶解溫度48.1765℃,酶解時(shí)間3.0925 h。優(yōu)化得到低聚木糖的產(chǎn)量預(yù)測值為23.7647 mg/g。為了驗(yàn)證本試驗(yàn)?zāi)P皖A(yù)測值的準(zhǔn)確性和可操作性,調(diào)整酶解條件為:起始pH 5.5,木聚糖酶添加量201 U/g,纖維素酶添加量248 U/g,酶解溫度48℃,酶解時(shí)間3 h。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),低聚木糖的平均產(chǎn)量為23.8673 mg/g,與預(yù)測值接近,說明此模型能準(zhǔn)確預(yù)測低聚木糖的產(chǎn)量。

    3 結(jié)論

    啤酒糟制備低聚木糖飼料添加劑的工藝為:酶解起始pH 5.5,木聚糖酶添加量201 U/g,纖維素酶添加量248 U/g,酶解溫度48℃,酶解時(shí)間3 h。通過驗(yàn)證試驗(yàn),測得啤酒糟中低聚木糖的平均含量為23.8673 mg/g,與理論值相對誤差僅為0.43%,說明采用響應(yīng)面分析法對利用啤酒糟制備含低聚木糖飼料添加劑酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化是有效的。

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