HPLC方法同步測(cè)定四黃止痢復(fù)方中黃芩苷和小檗堿的含量

王 培， 鐘文詩(shī)， 孫嘉一， 徐子恒， 蔣 紅，王宏軍

（錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

四黃止痢組方源自《中國(guó)獸藥典》（2015版），由黃芩 （Scutellaria baicalensis Georgi）、 黃柏（Phellodendron chinense Schneid）、 黃 連 （Coptis chinensis Franch）、大 黃 （Rheum offcinale Baill）、甘草 （Glycyrrhiza uralensis Fisch）、板藍(lán)根（Isatis tinctoria L）六味中草藥組成，能有效治療雞、豬的濕熱瀉痢，雞大腸桿菌病等，具有清熱瀉火、解毒止痢等功效。熊玥等（2015）在四黃止痢顆粒制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中僅涉及到黃芩苷的高效液相色譜（HPLC）含量檢測(cè)，未見對(duì)其他成分的HPLC檢測(cè)；賈紀(jì)萍等（2017）用薄層色譜定性鑒別了四黃止痢顆粒制劑中的鹽酸小檗堿和黃芩苷，未進(jìn)行定量分析。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以甲醇為提取溶劑，旨在建立HPLC同步測(cè)定四黃止痢復(fù)方中黃芩苷與小檗堿的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 高效液相色譜儀 （L-7420），日本日立公司，配四聯(lián)泵、脫氣泵、紫外檢測(cè)器和柱溫箱；色譜柱，島津InertSustian C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）， 天津市尚亞科技發(fā)展有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-5203），上海亞榮生化儀器廠；超聲波清洗器（KQ-300B），昆山市超聲儀器有限公司。甲醇（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；甲醇（色譜純），天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；磷酸（分析純），天津南開大學(xué)精細(xì)化工股份有限公司。黃連、黃芩、黃柏、大黃、板藍(lán)根、甘草購(gòu)自遼西國(guó)藥店。鹽酸小檗堿、黃芩苷對(duì)照品購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水梯度洗脫，有機(jī)相洗脫梯度為：0～5 min，20%～30%甲醇；5～10 min，30% ～40%甲醇；10～20 min，40% ～55%甲醇；20～30 min，55% ～60%甲醇；30～40 min，60% ～70%甲醇；40～ 50 min，70%～20%甲醇，流速1.0 mL/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為 278 nm；進(jìn)樣量 10 μL。

1.3 樣品處理 將黃連、黃柏、黃芩、板藍(lán)根、大黃、甘草6味中草藥按照《中國(guó)獸藥典》收載處方配比粉碎，稱取復(fù)方中草藥粉末5.0 g。按1∶80料液比加入60%甲醇，超聲處理30 min后，離心取上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干。用1 mL甲醇溶解，即為待測(cè)樣品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將黃芩苷、鹽酸小檗堿用甲醇稀釋成0.01～0.12 mg/L的系列工作標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行液相色譜分析。每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3次，取平均值繪制色譜峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 加樣回收率 稱取6份已測(cè)定的黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的復(fù)方中草藥提取物樣品0.1 g，按1.3方法制備供試溶液，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)液，在1.2色譜條件下檢測(cè)，重復(fù)6次，分析樣品回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇 在國(guó)標(biāo)基礎(chǔ)上以甲醇與0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，調(diào)整不同時(shí)間段流動(dòng)相梯度，以黃芩苷、小檗堿能夠完全分離為主要指標(biāo)，且其他峰分離能夠滿足要求，獲得了適宜的流動(dòng)相洗脫梯度。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 黃傳俊等（2018）用HPLC法測(cè)定金蟬止癢膠囊中鹽酸小檗堿和黃芩苷的研究中，檢測(cè)波長(zhǎng)分別使用了265 nm和280 nm，在本實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm可同時(shí)檢測(cè)到黃芩苷和鹽酸小檗堿。

2.3 色譜分離 由圖1可知，在優(yōu)化的色譜分離條件下，黃芩苷和鹽酸小檗堿獲得了良好的分離，鹽酸小檗堿和黃芩苷兩種化合物的保留時(shí)間分別為 23.998 min和 28.998 min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將對(duì)照品系列濃度分別進(jìn)樣檢測(cè)，以色譜峰面積（S）和對(duì)照品濃度（C，mg/L）作線性回歸。在濃度為0.01～0.12 mg/L時(shí)，黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 S=2×107C+972477，R2=0.9964；鹽酸小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為S=1×108C+231802，R2=0.9973。

2.5 加樣回收率 由表1可知，鹽酸小檗堿的平均回收率為98.058%，RSD值為0.914%；黃芩苷的平均回收率為98.400%，RSD值為0.896%。

2.6 精密度與重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 在12 h內(nèi)不同時(shí)間段測(cè)定樣品中鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量，每個(gè)時(shí)間段重復(fù)進(jìn)樣5次，6個(gè)時(shí)間段中鹽酸小檗堿的平均含量為（4.68±0.06）mg/g，RSD 為 1.39%；黃芩苷的平均含量為（9.29±0.35）mg/g，RSD 為 3.74%。 結(jié)果表明本方法具有很好的精密度和重現(xiàn)性。

圖1 樣品和對(duì)照品HPLC色譜圖

表1 加樣回收率

3 結(jié)論

在甲醇-0.1%磷酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm條件下，可以同步檢測(cè)到四黃止痢復(fù)方中草藥提取物中黃芩苷、鹽酸小檗堿，并且該方法基線穩(wěn)定，重復(fù)性理想，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜1%，線性關(guān)系良好，兩種組分分離理想，回收率高，均在98%以上，能夠滿足檢測(cè)需求。所以本方法適宜同步測(cè)定四黃止痢復(fù)方中草藥提取物中的黃芩苷、鹽酸小檗堿含量。