2-吲哚啉酮衍生物預(yù)防給藥對(duì)放射性肺纖維化模型小鼠的防護(hù)作用

李婉瑩，高慧英，劉金芳2，，高 瑞，陳 慧，詹軼群，楊曉明3，，李長(zhǎng)燕

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032；2.北京正旦國(guó)際科技有限公司，北京 102206；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；4.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所，北京 102206）

肺是照射敏感器官[1]，照射對(duì)肺造成的損傷為進(jìn)展性的，分為2個(gè)階段。前一階段是放射性肺炎，主要表現(xiàn)為照射造成的DNA斷裂損傷，Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞直接死亡，氧自由基增多，炎癥細(xì)胞和炎癥因子浸潤(rùn)等[2-4]。后一階段是放射性肺纖維化（radiation pulmonary fibrosis，RPF），這一階段至今仍被認(rèn)為是不可逆轉(zhuǎn)的[3]。在臨床上，大量肺癌患者，尤其是非小細(xì)胞性肺癌患者需要采用放射治療，通常會(huì)伴隨肺部放射性損傷[1，5]。除此之外，暴露于照射環(huán)境也會(huì)造成肺部急、慢性損傷[5]。RPF為不可逆過程，現(xiàn)有治療如糖皮質(zhì)激素治療、氧療和抗肺纖維化藥物（吡非尼酮、尼達(dá)尼布）等僅能延緩或改善癥狀[4，6-7]，嚴(yán)重制約了肺癌患者放療效果，降低患者生存率。如何減輕放射對(duì)肺造成的損傷，提高患者生存質(zhì)量，是亟待解決的臨床問題。2-吲哚啉酮衍生物〔3-（3-pyridylmethylidene）-2-indolinone，PMID〕是基于核因子類紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nfr2）/Keap1通路篩選出的小分子化合物（C14H10N2O，相對(duì)分子質(zhì)量為222.24），為無(wú)定型結(jié)晶黃色粉末，具有抗氧化的作用[8-9]。本研究采用小鼠全胸單次放射的方法制備RPF模型，并設(shè)置給藥組和對(duì)照組，在長(zhǎng)期觀察后通過肺功能檢測(cè)和病理學(xué)等方法對(duì)小鼠肺纖維化程度進(jìn)行分析，進(jìn)而評(píng)估PMID對(duì)RPF的防護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品、試劑和主要儀器

6～8周齡C57BL/6J雌性小鼠72只，SPF級(jí)，購(gòu)于北京維通利華（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2006-0006，平均體質(zhì)量約為（18.7±0.8）g。

PMID（軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所合成），批號(hào)為20160901，純度99.22%；吡非尼酮（pirfenidone，PFD）（大連美侖生物有限公司）；Masson三色染色試劑盒（貨號(hào)G1340，北京索萊寶科技有限公司）；4%多聚甲醛、羧甲纖維素鈉（CMC-Na）、戊巴比妥鈉和生理鹽水注射液（石家莊四藥有限公司）；兔抗Ⅰ型膠原蛋白（alpha 2 chain of typeⅠcollagen，COL1A2）抗體（貨號(hào)A5786，武漢愛博泰克生物科技有限公司）；兔二步法檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)PV-9001）和DAB顯色液（貨號(hào)ZLI-9017）（北京中杉金橋有限責(zé)任公司）。

AniRes2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)（北京貝蘭博科技有限公司），NanoZoomer 2.0-HT（日本濱松），Olympus IX71顯微鏡，Co60照射源（軍事醫(yī)學(xué)研究院）。

1.2 小鼠放射性肺纖維化模型的制備及處理

72只6～8周齡C57/6J雌性小鼠隨機(jī)取60只進(jìn)行造模，其中12只為正常對(duì)照。造模前禁食12 h，用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，麻醉劑量為0.6 mg·kg-1，麻醉后將小鼠固定，使其胸部基本位于同一水平，暴露其兩腋下至胸骨劍突部位，照射部位面積約2 cm×2 cm，其余部位鉛磚屏蔽，采用Co60經(jīng)前胸單次照射，照射劑量為17.5 Gy，照射劑量率為104.53 cGy·min-1。

造模后，隨機(jī)分為模型對(duì)照組（0.5%CMC-Na）、PMID7.5，15.0和30.0mg·kg-1組及PFD15.0mg·kg-1組。實(shí)驗(yàn)前1周ig給藥，每天2次，間隔6 h，連續(xù)給藥2周。同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組（0.5%CMC-Na），以上小鼠均飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院動(dòng)物飼養(yǎng)中心屏障環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)設(shè)施合格證號(hào)：SYXK（軍）-2007-004。

1.3 肺功能檢測(cè)

用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性（pulmonary dynamic compliance，Cydn）是評(píng)估肺纖維化的2個(gè)經(jīng)典肺功能指標(biāo)。照射后26周，1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，麻醉劑量為0.75 mg·kg-1，麻醉后切開小鼠喉部正中，鈍性分離至氣管暴露，在第3～4軟骨環(huán)處做T型切口，插入氣管插管后用縫合線在氣管外打結(jié)固定，與體描箱氣路相連后關(guān)閉體描箱，采集數(shù)據(jù)。

1.4 HE染色檢測(cè)小鼠肺泡病理變化及Masson染色檢測(cè)膠原沉積

左肺浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、浸泡、包埋和切片（5 μm），對(duì)切片進(jìn)行HE染色，經(jīng)掃描后，根據(jù)Ashcroft肺纖維化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10-11]，在10倍鏡下以組織學(xué)特征為依據(jù)對(duì)HE片進(jìn)行全片連續(xù)評(píng)分，將肺纖維水平分為0～8個(gè)等級(jí)，取平均值為該片評(píng)分并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

Tab.1 Criteria for grading lung fibrosis（HE staining）

Masson染色常用于評(píng)估膠原沉積，大分子如膠原纖維被染成藍(lán)色，而小分子如肌纖維、胞漿等則被染成紅色。對(duì)小鼠肺組織切片進(jìn)行Masson染色，并運(yùn)用Image J軟件對(duì)藍(lán)染組織面積比例進(jìn)行量化分析。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)肺組織中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)

COL1是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白產(chǎn)物，可作為肺纖維化程度評(píng)估的重要指標(biāo)，采用免疫組織化學(xué)染色的方法特異性染COL1A2檢測(cè)COL1的表達(dá)，對(duì)肺組織病理切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理、抗原修復(fù)、阻斷過氧化物酶處理、BSA封閉后，一抗（1∶300）工作液37℃孵育1 h，孵育對(duì)應(yīng)的二抗工作液37℃，1 h后進(jìn)行DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，蘇木素染核后脫水封片，掃描。

1.6 RT-PCR檢測(cè)COL1A2 mRNA的表達(dá)

用RT-PCR定量檢測(cè)COL1A2mRNA的表達(dá)，從肺組織中提取總RNA，采用Thermo Scientific Revert Aid RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，COL1A2引物F：ATGTGCCACTCTGACTGGAA；R：TCCATCGGTCATGCTCTCTC。使用Agilent Mx3000P qPCR System實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，采用2-△△Ct法表示待測(cè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，通過GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠放射性肺纖維化模型的鑒定

模型組小鼠經(jīng)過全胸單次照射后4～6周，照射區(qū)域毛發(fā)開始變白，持續(xù)至26周（圖1A）。解剖后可見正常對(duì)照組小鼠肺呈淡粉色，形態(tài)正常，而模型組小鼠肺則有不同程度損傷，部分有發(fā)白、萎縮的情況出現(xiàn)（圖1B）。照射后小鼠生存率呈2個(gè)階段性下降，在終點(diǎn)第27周，模型組小鼠生存率為45%，中位生存期為178 d（圖1C），照射后2周小鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)明顯下降，之后有所回升，照射后第26周，模型組小鼠平均體質(zhì)量低于20 g，明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.01）（圖1D和E）。評(píng)估了照射26周后小鼠肺功能情況。結(jié)果顯示模型組小鼠肺功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，相較于正常對(duì)照組小鼠，F(xiàn)VC明顯下降（P＜0.01）（圖1F），Cydn也顯著下降（P＜0.01）（圖1G）。HE染色可見未照射小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，Masson染色未見明顯膠原沉積，而照射小鼠則出現(xiàn)嚴(yán)重肺病理?yè)p傷，喪失肺泡正常結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)大片融合現(xiàn)象，局部表現(xiàn)為完全的纖維化阻塞，Masson染色可見大片藍(lán)染區(qū)域（膠原沉積部位），說明照射小鼠肺部出現(xiàn)嚴(yán)重膠原累積（圖1H和I）?？傊?，照射后小鼠肺受到明顯損傷，呈現(xiàn)明顯纖維化改變，表明造模成功。

2.2 PMlD預(yù)處理可改善放射性肺纖維化小鼠的生存率和體質(zhì)量下降

Fig.1 Establishment of radiation pulmonary fibrosis（RPF）mouse model.Totally 72 female C57/6J mice aged 6-8 weeks were randomly divided into two groups：the normal control group（n=12）and the model group（n=60）.The mice were fasted for 12 h before anesthesia，and the mice were anesthetized with 1%sodium pentobarbital 0.6 mg·kg-1，exposed from underarms to the sternal process of the sternum.A single dose of Co6017.5 Gy whole chest irradiation was performed with a radiation dose rate of 104.53 cGy·min-1.A：appearance of irradiated and non-irradiated mice.After irradiation，the hair in the irradiated area of the mouse turned white，and there was hair loss to different degrees；B：lung appearance of mice（left）；C：survival rate of mice（right）；D：body mass of mice；E：body mass of mice at the 26thweek after irradiation（the end stage）.±s.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；F：forced vital capacity（FVC）at the end stage；G：pulmonary dynamic compliance（Cydn）at the end stage；H：HE staining；I：Masson staining.

照射后，各照射組小鼠出現(xiàn)不同程度的死亡，至27周終點(diǎn)期間，模型組小鼠生存率下降至45%，中位生存期為178 d；PMID 7.5 mg·kg-1組小鼠生存率下降至40%，未見改善；而PMID 15.0 mg·kg-1組、PMID 30.0 mg·kg-1組和PFD組小鼠中位生存期均＞189 d（圖2A）其中，PMID 15.0 mg·kg-1組小鼠在終點(diǎn)生存率為73%，較模型組生存率高28%，較PFD陽(yáng)性對(duì)照組生存率高15%（圖2B）。小鼠的死亡主要集中在照射后4周內(nèi)及第20周后，而在前一階段，PMID 15.0 mg·kg-1組和PMID 30.0 mg·kg-1組小鼠并未出現(xiàn)死亡（圖2A）。照射后1周內(nèi)各組小鼠體質(zhì)量出現(xiàn)明顯下降，并在1周后回升，25周后，模型組小鼠再次出現(xiàn)較明顯體質(zhì)量下降（圖2C）。至27周終點(diǎn)，各照射組小鼠平均體質(zhì)量均低于正常對(duì)照組小鼠平均體質(zhì)量，各照射組中模型組平均體質(zhì)量最低（圖2D）。

2.3 PMlD預(yù)處理可提高放射性肺纖維化小鼠的肺FVC和Cydn值

Fig.2 Effect of 3-（3-pyridylmethylidene）-2-indolinone（PMlD）on survival rate and body mass of RPF mice.PMID was given 1 week before the experiment,twice a day,at intervals of more than 6 h,for 2 weeks.A：survival rate of each group，staged declines happened within 4 and 20 weeks after irradiation；B：survival rate of model，PMID 15 mg·kg-1and PFD 15 mg·kg-1group；C1-C6：body mass of each group，irradiation mice showed staged declines in 1 to 25 weeks after radiation；D：body mass of each group.±s，n=12，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05 ，##P＜0.01，compared with model control group.

Fig.3 Effect of PMlD on lung respiratory function of RPF mice at 26 weeks after irradiation.See Fig.2 for the mouse treatment.x ± s，n=12，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model control group.

肺功能檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，Co60照射后26周后，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠FVC值〔（0.26±0.08）mL〕和 Cydn值〔（0.006±0.002）mL·cm-1H2O〕明顯下降（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，PMID各組小鼠肺功能下降情況得到明顯改善，其中PMID 7.5和15.0 mg·kg-1組小鼠FVC值分別為0.55±0.09和（0.52±0.05）mL（圖3A），Cydn值分別提升至0.019±0.004和（0.018±0.002）mL·cm-1H2O（P＜0.05）。

2.4 PMlD預(yù)處理可減輕放射性肺纖維化小鼠的肺病理?yè)p傷

HE染色結(jié)果（圖4）顯示，正常對(duì)照組小鼠肺部結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔無(wú)增厚，血管周圍無(wú)明顯細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)遭嚴(yán)重破壞，失去正常肺泡結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)大面積纖維化，血管周圍有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，甚至有“蜂窩肺”表現(xiàn)。與模型對(duì)照組相比，PMID各劑量組肺損傷有一定程度緩解，PMID 15.0和30.0 mg·kg-1組肺部基本可見正常結(jié)構(gòu)，肺泡壁有不同程度增厚，偶可見纖維帶或小纖維團(tuán)塊。

肺組織纖維化評(píng)分結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組肺組織纖維化評(píng)分0.84±0.19相比，模型對(duì)照組肺組織纖維化評(píng)分明顯升高，為5.99±0.69（P＜0.01）。與模型對(duì)照組相比，PMID 7.5和15.0 mg·kg-1組肺組織纖維化評(píng)分分別為2.75±0.45和2.65±0.42，明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.01）。

2.5 PMlD預(yù)處理可降低放射性肺纖維化小鼠的肺膠原含量

正常對(duì)照組肺泡間隔幾乎無(wú)膠原沉積（13.54±3.42）%，僅小血管周圍有一定膠原沉積。模型對(duì)照組則可見大量膠原物質(zhì)沉積（52.17±8.39）%（P＜0.01）。PMID各給藥組膠原沉積情況相較于模型對(duì)照組有明顯減輕，主要沉積于血管周圍沉積，肺泡壁僅有少量膠原沉積。其中，PMID 15.0 mg·kg-1組〔（15.55±3.40）%〕、30 mg·kg-1組〔（17.94%±4.70）%〕和PFD組〔（12.92±3.50）%〕藍(lán)染組織面積比例較模型對(duì)照組明顯下降（P＜0.01）（圖5）。

2.6 PMlD預(yù)處理可減少放射造成的Ⅰ型膠原形成

免疫組化結(jié)果（圖6A）顯示，正常對(duì)照組小鼠肺僅氣管周圍有少量COL1A2陽(yáng)性表現(xiàn)，而模型對(duì)照組視野內(nèi)可見大量COL1A2陽(yáng)性區(qū)域染色，PMID給藥組和PFD組COL1A2表達(dá)均有所下降，其中，PMID 7.5 mg·kg-1組陽(yáng)性反應(yīng)最弱。

Fig.4 Effect of PMlD on lung histopathological damage of RPF model mice at the 26thweek after irradiation by HE staining.See Fig.1 for the mouse treatment.B：the semi-quantitative result of A.±s，n=12，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model control group.

Fig.5 Effect of PMlD on lung collagen deposition of RPF model mice at the 26thweek after irradiation by massion staining.See Fig.2 for the mouse treatment.B：the semi-quantitative result of A.±s，n=12，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05 ，##P＜0.01，compared with model control group.

Fig.6 Effect of PMlD on expression of COL1A2 of RPF model mice by immunohistochemical staining（A）and RT-PCR（B）.See Fig.2 for the mouse treatment.±s，n=4，＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model control group.

RT-PCR的結(jié)果（圖6B）顯示，照射后，各組小鼠COL1A2mRNA均有升高。其中，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組COL1A2mRNA表達(dá)上升（P＜0.05）。與模型對(duì)照組相比，PMID 7.5 mg·kg-1組COL1A2mRNA表達(dá)下降（P＜0.05），與免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果相符，說明PMID預(yù)處理可減少輻射造成的COL1形成。

3 討論

17.5 Gy Co60單次全胸照射后2周內(nèi)及24周后，照射小鼠體質(zhì)量下降，活動(dòng)減少，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)死亡。在照射后4周，被照射小鼠開始出現(xiàn)照射區(qū)域皮毛變白的情況。長(zhǎng)期觀察小鼠生存率及體質(zhì)量變化，可見照射小鼠體質(zhì)量始終低于正常對(duì)照組小鼠體質(zhì)量，給予PMID或PFD可在一定程度上減輕小鼠的體質(zhì)量下降；照射后26周，模型組小鼠死亡過半，解剖發(fā)現(xiàn)小鼠肺出現(xiàn)局部肉眼可見損傷，甚至發(fā)白、萎縮；給予小鼠不同濃度的PMID可避免照射后小鼠的早期死亡發(fā)生。侵入性肺功能檢測(cè)結(jié)果說明，給予PMID能顯著改善照射造成的小鼠肺功能下降，并且，PMID 15 mg·kg-1組無(wú)論生存率還是肺功能的改善方面，效果均優(yōu)于PFD。HE染色可見，PMID預(yù)防給藥小鼠肺結(jié)構(gòu)較為正常，肺泡間隔增厚情況相較于模型組有明顯減輕，病理?yè)p傷評(píng)分由模型組的5.99±0.69降至2.88±0.60，說明對(duì)其病理?yè)p傷有明顯改善。Masson染色結(jié)果也說明，給予PMID預(yù)處理能有效減少照射后小鼠肺膠原物質(zhì)沉積。總之，PMID預(yù)防給藥能明顯減輕RPF小鼠肺纖維化病變，且效果優(yōu)于PFD。

RPF是一種進(jìn)展性肺損傷，伴有慢性炎癥和異常器官修復(fù)[4，7]，其特征包括肌成纖維細(xì)胞增生、膠原累積、肺泡間隙增厚和正常肺結(jié)構(gòu)的破壞[12]。模型組小鼠中表現(xiàn)為HE染色片中肺正常結(jié)構(gòu)損壞，肺泡間隔增高；Masson染色片中可見大量膠原纖維累積。異常修復(fù)過程會(huì)使肺失去正常結(jié)構(gòu)，原有的肺泡結(jié)構(gòu)和血管組織遭到破壞，影響肺正常呼吸功能，引起肺功能下降、血氧飽和度下降以及肺動(dòng)脈高壓等[6]。在RPF小鼠模型中可觀察到肺纖維化關(guān)鍵指標(biāo)FVC與Cydn的下降。慢性放射損傷本質(zhì)上是一種異常的傷口愈合，越來(lái)越多的證據(jù)表明，損傷表型由慢性炎癥維持，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的過度表達(dá)和激活，從而導(dǎo)致實(shí)質(zhì)細(xì)胞耗竭和過度纖維化[13-14]。

Nrf2在纖維化病變中起到重要作用。一方面，氧化應(yīng)激是RPF的主要機(jī)制之一[4，7，15-16]，Nrf2可與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，促進(jìn)下游抗氧化酶如NADPH醌氧化還原酶和血紅素加氧酶1的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用，起到保護(hù)細(xì)胞的作用[9，17]。除此之外，Nrf2可阻斷Smad2/3磷酸化，阻礙其復(fù)合物形成，從而抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β/Smad信號(hào)通路[18-20]，減少下游纖維化產(chǎn)物如COL1等的形成，發(fā)揮其抗纖維化作用[21-22]。本研究結(jié)果顯示，PMID發(fā)揮抗肺纖維化作用可能也與Nrf2對(duì)該通路的抑制作用有關(guān)。

綜上所述，PMID在RPF模型小鼠中表現(xiàn)出很好的防護(hù)作用，有望成為放射性肺纖維化的新型藥物，具有極大的臨床開發(fā)價(jià)值。