小檗堿表觀遺傳藥理作用研究進(jìn)展

張舒晨，高 斌，尚文斌，2

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)代謝病中醫(yī)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210029）

表觀遺傳學(xué)是指在不改變?cè)糄NA序列的情況下，通過(guò)多種修飾影響基因和蛋白活性并產(chǎn)生可遺傳的性狀。這些修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾（甲基化、乙?；?、磷酸化和泛素化等）及非編碼RNA等[2]。這些修飾通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)局部結(jié)構(gòu)，影響DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復(fù)與重組、蛋白表達(dá)及活性等許多過(guò)程，影響眾多疾病如癌癥[3]、糖尿病及其并發(fā)癥[4]和心血管疾病[5]等發(fā)生發(fā)展。表觀遺傳學(xué)改變?cè)谥T多生理病理中發(fā)揮了重要的作用[1]。

小檗堿為清熱解毒藥黃連的有效成分。多年來(lái)的臨床和實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)研究表明，小檗堿具有抗炎、抗腫瘤、抗病原微生物、調(diào)節(jié)糖脂代謝、保護(hù)心血管和免疫抑制等多種藥理作用，對(duì)癌癥、腸道感染性疾病、糖尿病、心血管疾病和阿爾茨海默病等具有防治作用[6-7]，其應(yīng)用前景廣闊。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠通過(guò)改變表觀遺傳修飾過(guò)程發(fā)揮藥理作用，對(duì)小檗堿在表觀修飾層面的深入研究有助于闡明其藥理作用的新靶點(diǎn)和新機(jī)制。

1 調(diào)控DNA甲基化

在真核生物中，DNA甲基化是從S-腺苷甲硫胺酸上轉(zhuǎn)移一個(gè)甲基至啟動(dòng)子中富含CpG序列區(qū)域的胞嘧啶的5號(hào)位[8]，這個(gè)過(guò)程被DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMT）所催化。DNA甲基化最主要的功能是改變基因表達(dá)，總的來(lái)說(shuō)，在基因表達(dá)區(qū)甲基化程度越高，基因的表達(dá)將會(huì)下降[2]。

DNA甲基化在腫瘤發(fā)生過(guò)程中常見(jiàn)，許多促癌基因由于甲基化降低而被激活，抑癌基因被高甲基化而沉默[9]。非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）和2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）及其并發(fā)癥在分子生物學(xué)水平也可檢測(cè)到大量涉及糖代謝、炎癥和氧化應(yīng)激等通路上DNA甲基化改變[10-11]。目前研究表明，針對(duì)不同疾病或同一疾病不同治療機(jī)制，小檗堿既可以提高特定區(qū)域DNA甲基化，又可以促進(jìn)特定區(qū)域DNA去甲基化。

1.1 DNA甲基化作用

小檗堿可以提高促癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平以抑制其表達(dá)。組成型雄甾烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）可以調(diào)控肝糖異生，并促進(jìn)肝癌發(fā)生。在過(guò)表達(dá)CAR的HepG2細(xì)胞上給予5～25 μmol·L-1不等的小檗堿后，可以檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)總的DNA甲基化程度增強(qiáng)，其中CAR及其靶基因細(xì)胞色素P450酶家族的CYP2B6和CYP3A4基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平升高，因此CAR和P450表達(dá)被抑制，其他抗腫瘤表現(xiàn)可見(jiàn)細(xì)胞凋亡增多、細(xì)胞周期停滯、活性氧生成減少，同時(shí)還可以提高代謝酶的穩(wěn)定性，延緩肝癌的發(fā)生[12]。

1.2 DNA去甲基化作用

小檗堿的抗癌機(jī)制不僅表現(xiàn)在能夠抑制促癌基因表達(dá)，而且還能通過(guò)抑制DNMT的表達(dá)及活性，降低抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度，使抑癌基因表達(dá)增多，發(fā)揮抗癌效應(yīng)。DNMT包含3種酶，其中DNMT1起到維持甲基化的作用，其異常表達(dá)對(duì)癌癥發(fā)展有重要影響[13]，DNMT1的失活會(huì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子P53蛋白的磷酸化以激活下游DNA損傷通路，促使癌細(xì)胞凋亡從而防止癌變。因此DNMT1是一個(gè)潛在的良好的癌癥治療靶點(diǎn)[14]。應(yīng)用小檗堿干預(yù)人腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)DNMT1和DNMET3B基因表達(dá)及蛋白水平顯著下降，由此帶來(lái)全細(xì)胞尤其是P53及其下游與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度降低，從而激活P53依賴的細(xì)胞凋亡過(guò)程發(fā)揮抗癌作用[15-16]。還有在人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中應(yīng)用小檗堿的研究，發(fā)現(xiàn)小檗堿可以降低錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)，上調(diào)其表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)小檗堿與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)卵巢癌細(xì)胞有較強(qiáng)的協(xié)同抗癌作用[17]。

小檗堿治療代謝性疾病中DNA甲基化的異常，主要是通過(guò)恢復(fù)代謝通路中的關(guān)鍵基因的表達(dá)，促進(jìn)糖和脂類(lèi)的利用與轉(zhuǎn)化，緩解肝變性。現(xiàn)有研究證明，小檗堿可以恢復(fù)異常的L型丙酮酸激酶（L-pyruvate kinase，L-PK）和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（microsomal triglycerides transfer protein，MTTP）甲基化。在NAFLD模型的SD大鼠中檢測(cè)到由于LPK基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化程度升高因而在肝的表達(dá)降低，L-PK對(duì)細(xì)胞增殖、葡萄糖利用和甘油三酯代謝有顯著的促進(jìn)作用。口服小檗堿可通過(guò)L-PK啟動(dòng)子去甲基化恢復(fù)L-PK的表達(dá)，促進(jìn)代謝[18]。MTTP是一種主要分布于肝細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白，其在甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)及極低密度脂蛋白組裝和分泌中發(fā)揮著重要作用，并與血脂障礙和肝脂肪變性等疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[19]。在高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝中，MTTP啟動(dòng)子的甲基化水平明顯升高，其表達(dá)被抑制；小檗堿可以逆轉(zhuǎn)基因表達(dá)的下調(diào)，并抑制由于HFD導(dǎo)致的MTTP啟動(dòng)子甲基化的增加，從而增加肝甘油三酯的輸出，改善HFD誘導(dǎo)的脂肪肝[20]。

2 調(diào)控蛋白乙?；?/h2>

組蛋白和各類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子上賴氨酸乙?；浅Ｒ?jiàn)而重要的的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases，HAT）和組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylases，HDAC）共調(diào)控此過(guò)程的動(dòng)態(tài)平衡[2]。在高等生物中，HDAC可分為4類(lèi)，即依賴鋅離子發(fā)揮作用的Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ類(lèi)HDAC（HDAC 1～11）和依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的Ⅲ類(lèi)HDAC，又稱(chēng)為Sirtuins家族（SIRT 1～7）[21]。HDAC既可以在染色質(zhì)水平上通過(guò)對(duì)組蛋白的去乙?；€(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)，抑制基因轉(zhuǎn)錄，也可以通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子等非組蛋白進(jìn)行去乙?；泻虷AT作用，并能促進(jìn)HAT與沉默因子的結(jié)合而發(fā)揮抑制作用[22]。

由于HDAC與HAT表達(dá)水平顯著改變，導(dǎo)致全細(xì)胞乙?；降膭?dòng)態(tài)平衡被打破，各種轉(zhuǎn)錄因子能與促癌基因特異性結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄促使癌癥的發(fā)生。同樣，在代謝性疾病中通路上關(guān)鍵酶的乙酰化狀態(tài)也被改變，并可與DNA甲基化修飾協(xié)同或拮抗，對(duì)各信息分子產(chǎn)生沉默或激活作用，影響各代謝過(guò)程。小檗堿可以通過(guò)抑制HDAC和促進(jìn)Sirtuins恢復(fù)乙?；瘎?dòng)態(tài)平衡，對(duì)HAT的調(diào)控研究尚且不足。

2.1 促進(jìn)蛋白乙?；?/h3>

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，小檗堿可能通過(guò)抑制HDAC的表達(dá)及活性改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)乙?；桨l(fā)揮抗腫瘤作用。在人肺癌細(xì)胞A549中小檗堿通過(guò)抑制總HDAC，尤其是Ⅰ，Ⅱ和Ⅳ類(lèi)HDAC的活性，使得組蛋白乙?；潭燃眲∩仙?，并觸發(fā)亞G0/G1細(xì)胞周期進(jìn)展階段的正向調(diào)控，抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)[23]。將小檗堿給予HeLa細(xì)胞檢測(cè)到HDAC1和HDAC2表達(dá)明顯下降，通過(guò)分子模擬對(duì)接顯示小檗堿在HDAC1和HDAC2上可能存在結(jié)合位點(diǎn)。在多種血液腫瘤細(xì)胞系中小檗堿的刺激提高了組蛋白乙?；剑@與CREBBP和EP300的表達(dá)上調(diào)和HDAC8的表達(dá)輕度下調(diào)等有關(guān)[24]。數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，小檗堿可能抑制HDAC和AKT通路蛋白合成，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬，并顯示小檗堿可以誘導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)HDAC6的底物α-小管蛋白的乙酰化，阻礙HDAC6與其結(jié)合發(fā)揮功能，而非直接抑制HDAC活性[25]。此外，小檗堿和泛HDAC抑制劑SAHA共同作用，通過(guò)提高染色質(zhì)特定區(qū)域組蛋白乙?；?，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡及分化相關(guān)蛋白的表達(dá)和穩(wěn)定性，協(xié)同抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[25]。

上文所述的L-PK在NAFLD大鼠肝中的表達(dá)降低不但受到基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA高甲基化影響，與L-PK基因周?chē)M蛋白乙?；慕档鸵灿嘘P(guān)。口服小檗堿可通過(guò)L-PK啟動(dòng)子去甲基化并同時(shí)升高L-PK周?chē)M蛋白H3和H4乙?；瘉?lái)恢復(fù)L-PK的表達(dá)，改善糖尿病糖脂代謝紊亂[18]。

2.2 促進(jìn)蛋白去乙?；?/h3>

Ⅲ類(lèi)HDAC中的SIRT1參與了包括基因轉(zhuǎn)錄、能量代謝以及細(xì)胞衰老過(guò)程的調(diào)節(jié)等許多生理過(guò)程，連接了代謝和炎癥等多通路的交互。大量研究表明，小檗堿可以促進(jìn)SIRT1的表達(dá)，因此可以產(chǎn)生改善代謝、抗炎、保護(hù)心血管等多種效應(yīng)。

在肥胖和糖尿病模型動(dòng)物中SIRT1的表達(dá)下降，并且在SIRT1基因敲除小鼠中會(huì)出現(xiàn)胰島素抵抗和糖脂代謝異常。小檗堿通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1及其下游過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ共激活因子1α以激活A(yù)MPK和AKT通路，從而增加胰島素敏感性；同時(shí)激活的SIRT1還可以去乙?；渭っ窧1（liver kinase B1，LKB1），激活A(yù)MPK通路，最終改善胰島素抵抗[26]。小檗堿對(duì)SIRT1的上調(diào)還可以抑制氧化應(yīng)激所致的肝細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)產(chǎn)生成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21），以此增加肝胰島素敏感性及維持體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，刺激能量消耗，改善肝脂肪變性[27]。

SIRT1也在炎癥反應(yīng)中起到一定作用，慢性炎癥作為一種防御反應(yīng)，本身是一種獨(dú)立的疾病，同時(shí)也參與了許多疾病的發(fā)生。與炎癥密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）對(duì)機(jī)體損傷和感染的免疫和炎癥反應(yīng)起主要調(diào)節(jié)作用[28]。在慢性炎癥期間，NAD+和SIRT1水平顯著降低，其P65上第310位賴氨酸乙?；梢酝耆罨疦F-κB的功能[29-30]，激活SIRT1可以對(duì)NF-κB/P65的去乙?；瑴p輕炎癥反應(yīng)[31]。經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)，P65的乙?；矫黠@上升，而給予不同濃度的小檗堿后通過(guò)SIRT1的去乙?；饔茫沟肞65的乙?；接幸欢ǔ潭鹊南陆?，并使NF-κB與DNA的結(jié)合能力減弱，從而抑制下游炎癥信號(hào)通路的活動(dòng)，發(fā)揮抗炎效應(yīng)[32]。

SIRT1的表達(dá)和活性下降還會(huì)導(dǎo)致心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心臟肥大和心力衰竭等的發(fā)生，這可能與引起的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和NF-κB的增加和促炎途徑的激活有關(guān)。也有研究表明，SIRT1的下調(diào)會(huì)促進(jìn)線粒體氧化應(yīng)激的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子p66Shc表達(dá)，發(fā)生持續(xù)性血管障礙[33]。小檗堿通過(guò)上調(diào)SIRT1、B淋巴細(xì)胞瘤2蛋白（B-cell lymphoma-2，BCL-2）表達(dá)以及下調(diào)BCL-2相關(guān)X蛋白（BCL-2 associated X protein，BAX）和胱天蛋白酶 3表達(dá)以發(fā)揮心臟保護(hù)作用；還降低心肌超氧化物生成和心肌炎癥標(biāo)志物水平，增加心肌超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平，顯著提高心梗后的心功能恢復(fù)，減少心梗面積，防止心梗損傷[34]。

3 調(diào)控組蛋白甲基化

組蛋白的甲基化修飾主要發(fā)生在H3和H4的賴氨酸和精氨酸殘基上，由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone methyltransferases，HMT）催化，其調(diào)控作用取決于甲基化位點(diǎn)和甲基化程度，較乙?；鼮閺?fù)雜而穩(wěn)定，能夠影響長(zhǎng)期表觀遺傳記憶，并常與乙?；揎椣嗯懦?，精密地調(diào)控著基因表達(dá)的過(guò)程[35]。

組蛋白甲基化的異常會(huì)影響細(xì)胞活動(dòng)，導(dǎo)致多種癌癥的發(fā)生。小檗堿可以修復(fù)這種異常，但相關(guān)研究目前還不深入。在多種血液腫瘤細(xì)胞中給予一定濃度小檗堿治療后，H3K4，H3K2和H3K36等多個(gè)與基因沉默和轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)的位點(diǎn)甲基化水平下降，有效促進(jìn)了抑癌基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，這與細(xì)胞內(nèi)組蛋白脫甲基酶KDM6A表達(dá)上調(diào)而組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶WHSC1Ⅰ，WHSC1Ⅱ和SMYD3下降有關(guān)，并且有分子模擬對(duì)接結(jié)果顯示，賴氨酸-N-甲基轉(zhuǎn)移酶可能為小檗堿的潛在靶點(diǎn)[24]。

4 展望

國(guó)內(nèi)外許多研究表明，小檗堿部分通過(guò)表觀遺傳學(xué)改變機(jī)制發(fā)揮多種藥理作用（圖1）。表觀遺傳修飾是許多疾病的重要病理機(jī)制，也是目前生物醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)。

根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)：①小檗堿一定程度上可以改變DNA甲基化、蛋白乙?；图谆?，從而影響下游通路發(fā)揮效應(yīng)。然而小檗堿在不同分子區(qū)域?qū)ν环N表觀遺傳修飾可能會(huì)產(chǎn)生增強(qiáng)和抑制2種相反的作用，其具體規(guī)律還需進(jìn)一步論證。并且現(xiàn)有的研究中尚未明確小檗堿確切的作用靶點(diǎn)，如小檗堿是否與相關(guān)修飾酶直接結(jié)合，以及完整清晰的作用途徑。②目前的研究范圍較局限，小檗堿是否通過(guò)其他表觀遺傳改變產(chǎn)生作用的相關(guān)研究較少；由于小檗堿可以同時(shí)改變多種修飾狀態(tài)，產(chǎn)生連續(xù)或疊加效應(yīng)，但具體的交互調(diào)控關(guān)系等也不十分清楚。例如，DNMT1可以對(duì)去乙酰化酶類(lèi)產(chǎn)生調(diào)控作用[36]，而小檗堿作為可能的DNMT1抑制劑，是否可以通過(guò)調(diào)控DNMT1改變HDAC表達(dá)和活性尚待證明。同樣小檗堿也是可能的HDAC抑制劑，是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他表觀修飾酶的乙酰化來(lái)發(fā)揮作用也可進(jìn)一步探索。③目前的研究均在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中展開(kāi)，尚缺乏涉及表觀遺傳的臨床試驗(yàn)的研究。如果可以改造并應(yīng)用，將有可能成為治療癌癥等疾病的新藥物，因此小檗堿還有廣闊的研究前景。

圖1 小檗堿通過(guò)表觀遺傳修飾發(fā)揮藥理作用的機(jī)制.DNMT：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；HDAC：組蛋白脫乙酰酶；HMT：組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶；SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)因子1；AMPK：AMP依賴的蛋白激酶；AKT：蛋白激酶B；NF-κB：核因子-κB.

鑒于小檗堿具有顯著的藥理作用，臨床運(yùn)用多樣且療效確切，而現(xiàn)有研究表觀遺傳作用機(jī)制可能是小檗堿藥理作用分子機(jī)制的重要基礎(chǔ)，其抑制DNMT1和HDAC的作用是明確的，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代，小檗堿有可能成為表觀遺傳修飾作用靶點(diǎn)明確的治療藥物。所以，還需進(jìn)一步對(duì)其表觀遺傳藥理作用機(jī)制進(jìn)行更加廣泛而深入的研究，更快更好地闡明其明確的分子機(jī)制，并拓展其臨床運(yùn)用和潛在價(jià)值。