響應(yīng)面法優(yōu)化當歸多糖超聲提取工藝研究

李海燕，范明輝，時薛麗，范景輝，*

（1.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院藥學部，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院心臟重癥醫(yī)學科，黑龍江 牡丹江 157011）

當歸為傘形科植物當歸Aaugellica sinensis（Oliv.）Diels.干燥根，甘、辛，溫。具有補血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤腸通便的功效[1-3]。其主要成分為阿魏酸、揮發(fā)油和多糖。當歸多糖是當歸的有效成分之一，是當歸活血、補血的中藥物質(zhì)基礎(chǔ)，研究表明，當歸多糖具有多種免疫活性，具有抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能以及鎮(zhèn)痛等作用[4-8]。Box-Behnken 是采用多元二次方程來擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，尋求最佳的工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法[9-14]。有關(guān)當歸多糖提取的報道較多，但利用響應(yīng)面法優(yōu)選當歸多糖超聲提取工藝的文獻還未見報道，本文采用超聲波提取法提取當歸多糖，結(jié)合響應(yīng)面法對數(shù)據(jù)進行分析，優(yōu)選最佳的提取工藝，為下一步研究提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

紫外可見分光光度計（Cary100）：美國VARIAN（瓦里安）公司；超聲波提取器（HN-1000CT）：上海漢諾儀器有限公司；中藥材粉碎機（FW177 型）：天津市泰斯特儀器有限公司；數(shù)控超級恒溫水?。⊿C-15 型）：寧波海曙天恒儀器廠；電熱鼓風干燥箱（101-0 型）：上?？瞥綄嶒炘O(shè)備有限公司；電子天平（BSA224S）：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

當歸藥材：產(chǎn)地甘肅，批號160307，經(jīng)鑒定為傘形科植物當歸 Aaugellica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根；水為重蒸水；葡萄糖、苯酚、濃硫酸等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 當歸多糖的含量測定

2.1.1 當歸多糖的超聲提取

樣品烘干→粉碎過篩→脫脂→超聲提取→抽濾→濃縮→脫色→醇沉→離心分離→沉淀物用丙酮、乙醚清洗→干燥→得多糖。

2.1.2 標準曲線的建立

精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖50 mg，蒸餾水定容至100 mL 的容量瓶中，得到濃度為0.5 mg/mL的葡萄糖對照品。精密量取葡萄糖對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于 50 mL 的容量瓶中，蒸餾水定容，搖勻。各精密吸取2.0 mL 置干凈的試管中，各管加入5%的苯酚1 mL，混勻，迅速加入濃硫酸6 mL，搖勻，靜置10 min 后，放入90 ℃水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，在490 nm 處測定吸光度，以濃度（c：μg/mL）為橫坐標，以吸光度 A 為縱坐標，繪制得到標準曲線。y=0.005 8x+0.022 7，r2=0.999 2。線性關(guān)系良好。

2.1.3 當歸多糖的含量測定

精密稱取提取的當歸多糖100 mg，置于小燒杯中，溶解，定容至100 mL 的容量瓶中，濃度為1 mg/mL，精密稱取1 mg/mL 的當歸多糖溶液5 mL，用蒸餾水定容于50 mL 的容量瓶中，使成濃度為0.1 mg/mL。吸取2 mL 置于干凈的試管中，各管加入5%的苯酚1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸6 mL，搖勻，放入90 ℃水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，在490 nm 處測定吸光度。計算當歸多糖的提取率。

2.1.4 當歸多糖提取率的計算

2.2 單因素試驗

2.2.1 液料比

稱取脫脂處理后的當歸粉末5 g，加入液料比為10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）的水，選擇功率400 W，超聲溫度50 ℃，超聲提取1 h，處理后測定多糖含量。液料比對當歸多糖提取率的影響見圖1。

圖1 液料比對多糖提取率的影響Fig.1 Effects of different solid-liquid ratio on polysaccharide extraction rate

結(jié)果表明隨著液料比的增加，多糖的提取率上升，當液料比為 20 ∶1（mL/g）時，多糖的提取率最高，當液料比超過 20 ∶1（mL/g）時，多糖的提取率減小，但變化的不明顯。因此選擇液料比 15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1（mL/g）進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.2.2 功率

稱取脫脂處理后的當歸粉末5 g，選擇液料比為20 ∶1（mL/g），功率為 300、400、500、600、700 W，超聲溫度50 ℃，超聲提取50 min，處理后測定多糖含量，見圖2。

圖2 功率對多糖提取率的影響Fig.2 Effects of different ultrasonic power on polysaccharide extraction rate

結(jié)果表明隨著功率的增加，多糖提取率上升，當功率超過500 W 時，多糖提取率基本不變，當功率超過500 W 時，功率的增加對多糖提取率的影響較小。因此，在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中固定功率為500 W。

2.2.3 提取時間

稱取脫脂處理后的當歸粉末5 g，選擇液料比為20 ∶1（mL/g），功率為 500 W，超聲溫度 50 ℃，超聲提取30、40、50、60、70、80 min，處理后測定多糖提取率，見圖3。

圖3 提取時間對多糖提取率的影響Fig.3 Effects of different time on polysaccharide extraction rate

結(jié)果表明隨著超聲時間的增加，多糖提取率上升當超聲時間為60 min 時，多糖含量最高，然后隨超聲時間增加提取率下降。因此選擇超聲時間50、60、70 min進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.2.4 超聲溫度

選擇液料比為 20 ∶1（mL/g），功率為 500 W，超聲時間 60 min 考察不同超聲溫度 25、35、45、55、65 ℃對多糖提取率的影響，見圖4。

圖4 超聲溫度對多糖提取率的影響Fig.4 Effects of different temperature on polysaccharide extraction rate

結(jié)果表明隨著超聲溫度的增加，多糖提取率上升。當超聲溫度為35 ℃時，多糖提取率最高，然后隨超聲溫度增加提取率下降，可能是溫度過高破壞了多糖的結(jié)構(gòu)。因此選擇超聲溫度25、35、45 ℃進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.3 響應(yīng)面分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，由于功率超過500 W時，多糖提取率基本不變，因此固定功率為500 W。利用Box-Benhnken 的設(shè)計原理，選取超聲溫度（A）、液料比（B）、超聲時間（C）3 個因素，選取 3 個水平以-1、0、1 為編碼，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析對當歸多糖提取率進行優(yōu)化。共設(shè)計17 個試驗點，其中1號～12 號是析因設(shè)點，13 號～17 號是零點，試驗因素及編碼見表1，響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 因素及水平Table 1 Factors and levels

表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

續(xù)表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Continue table 2 Response surface experimental design and results

通過回歸分析，得到當歸多糖提取率（Y）與超聲溫度（A）、液料比（B）、超聲時間（C）的二次多項回歸模型：Y=-17.60+0.201 5A+0.962 4B+0.417 0C-0.004 483A2-0.021 93B2-0.003 632C2+0.000 550AB+0.001 925AC-0.001 850BC。歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

從表3 可知，模型的P＜0.01，表明回歸模型極顯著；失擬項P＞0.05，失擬項不顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.992 7，說明模型擬合程度較好。該模型能夠解釋98.32%的響應(yīng)值變化。因此，可以利用此模型來分析和預(yù)測當歸多糖的提取工藝條件。應(yīng)用minitab 軟件，得到響應(yīng)面的分析圖見圖5～圖7。

圖5 超聲溫度和液料比對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of temperature and solid-liquid ratio on polysaccharide extraction rate

圖6 超聲溫度和超聲時間對多糖提取率的影響Fig.6 Effect of temperature and time on polysaccharide extraction rate

圖7 液料比和超聲時間對多糖提取率的影響Fig.7 Effect of solid-liquid ratio and time on polysaccharide extraction rate

對參數(shù)進行優(yōu)化，得到最佳的工藝條件為：超聲溫度：37.12 ℃、液料：19.75 ∶1（mL/g）、超聲時間62.12 min。該條件下當歸多糖的提取率為8.621 71%。

2.4 驗證試驗

為了驗證響應(yīng)面試驗的可行性，利用響應(yīng)面試驗得到的最佳工藝條件進行試驗，考慮到實際操作的便利性選擇超聲溫度 37 ℃、液料比 20 ∶1（mL/g）、超聲時間62 min。精密稱取當歸粉末5 g，在最后確定的工藝條件下提取當歸多糖，平行測定3 次，得到多糖得率平均值為8.63%，與預(yù)測值接近，表明該模型可靠，可用于當歸多糖的超聲提取。

3 結(jié)論

本次試驗通過超聲輔助提取了當歸中的多糖，通過響應(yīng)面試驗分析，找到了超聲提取當歸多糖的最佳控制點，通過響應(yīng)面試驗得到最佳的提取條件為：37 ℃、液料比 20 ∶1（mL/g）、提取時間 62 min，提取率為8.63%，與模型的估計值相近，說明用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型準確、可靠。與正交試驗相比，響應(yīng)面法更能準確地確定最佳的工藝條件。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件準確可靠、提取率高，具有實用價值。