石斛鮮汁加工方法對總生物堿溶出量影響研究

陳敏，陳婧超，黃文璐，劉淑蕓，薛青榮，馮英鵬，惠愛玲，張文成

（農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，合肥工業(yè)大學，安徽 合肥 230009）

鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱等功效，中國藥典2010 版、2015 版均有收載。藥效成分分析顯示其主要含有多糖、總生物堿等[1]，其中石斛多糖具有增強免疫力、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[2-3]；總生物堿具有胃腸道保護、神經(jīng)保護等作用[4-8]。鑒于此，由鐵皮石斛開發(fā)的保健品達50 種以上，劑型包括顆粒劑、軟膠囊、含片等[9]。歷代醫(yī)家認為：鮮石斛清熱生津之功效較干石斛為好。著名方劑如“三鮮湯”、“葉氏養(yǎng)胃湯”等，均以鮮石斛入方；近代郝近大教授研究發(fā)現(xiàn)鮮石斛中還原糖及生物堿含量遠高于干品（總生物堿含量鮮品1.226%，干品0.65%）[10]。近年來，隨著人工培植石斛技術(shù)的成熟，石斛鮮品的供應(yīng)和銷售規(guī)模逐步擴大；再加上人們養(yǎng)生保健意識的提高，石斛鮮用的傳統(tǒng)也在復蘇中得以繼承和發(fā)揚[11]。石斛鮮用，以鮮條加水榨汁居多。鮮榨石斛汁（或石斛鮮汁）可較好地保留鮮石斛中的熱敏性成分，同時具有生鮮風味，故石斛鮮汁備受消費者追捧。然而，總生物堿一般不溶于水，其在石斛鮮汁中難以溶出，這并不利于其保健功效充分發(fā)揮。對石斛中總生物堿提取常采用70%～95%EtOH 或氯仿加熱進行[12-15]；多糖也多采用熱水浸提法，必要時還輔以超聲波、微波等[16-18]。前期研究表明：采用超高壓技術(shù)處理霍山米斛鮮汁，一方面實現(xiàn)了有效殺菌，同時石斛多糖溶出量較高壓前提高15.49%，而對生物堿溶出提高甚微（3.49%）[19]。

本研究以安徽霍山鐵皮石斛為試驗原料，模擬日常生活中石斛鮮汁的制備過程，研究了鮮條預處理（切段、凍藏）、榨汁過程各因素（加水量、水溫、pH 值）、超聲波輔助處理及后續(xù)殺菌、貯藏等對石斛汁中總生物堿溶出量的影響，這為石斛的高效利用及其深加工提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）鮮條：三年生，安徽霍山縣長沖中藥材開發(fā)有限公司，莖長15cm～20 cm，直徑0.5cm～0.8 cm。

檸檬酸、檸檬酸鈉、溴甲酚綠、吐溫-80：國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；石斛堿標準品（液相色譜檢測含量大于98%）：上海源葉生物科技有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-C051 榨汁機（功率250 W，轉(zhuǎn)速15 500 r/min～22 000 r/min）：山東九陽股份有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器有限公司；XM-80A 微型渦旋混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；TDZ5-WS 低速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；JY98-3DN超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；V-5000 可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；SHP-250 生化培養(yǎng)箱：上海精密設(shè)備有限公司；UVT-1超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 石斛鮮汁制備

石斛鮮條→挑選（粗細、長短等均一）去除葉鞘→清洗→切段、凍藏（可選）→榨汁（加水）→超聲波強化→過濾、脫氣、真空封裝（耐高溫PE 袋）→巴氏殺菌→冷藏

1.3.2 石斛中總生物堿檢測

1.3.2.1 石斛中總生物堿提取及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測

將6 g 石斛鮮條切段并勻漿，按料液比1∶15（g/mL）加入 95%EtOH 或 75%酸性乙醇（pH 3）[12]、氨水氯仿[15]于圓底瓶內(nèi)，水浴 80 ℃～85 ℃回流提取 2 次，每次 3 h，合并濾液，減壓濃縮，測總生物堿含量；粗生物堿溶于乙腈，0.22 μm 濾膜過濾，對不同提取溶劑中總生物堿組成進行HPLC 分析。

HPLC 條件 ：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈：0.1%三乙胺=50 ∶50（體積比），流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：215 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

1.3.2.2 石斛汁中總生物堿溶出量檢測

生物堿標準曲線制作過程：精密量取石斛堿標準儲備液（1 mg/mL）0、100、200、300、400、500、600、700 μL分別置于25 mL 具塞試管中，用氯仿準確稀釋至6 mL，加入pH 4.5 緩沖液3 mL 和溴甲酚綠溶液1 mL，200 μL吐溫-80 水溶液，渦旋3 min，靜置30 min，取氯仿層5 mL，加入現(xiàn)配0.01 mol/L 氫氧化鈉-無水乙醇溶液1 mL，搖勻后測吸光度。以石斛堿質(zhì)量（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，Y = 0.084 8 X-0.023 2，R2=0.993 4。由于鐵皮石斛總生物堿含量僅為霍山米斛1/5～1/10，鐵皮石斛汁中生物堿溶出量太低導致其吸光度太小而不易檢出，結(jié)合文獻[20]在該方法中加入體積比1 ∶60 吐溫-80 水溶液，石斛總生物堿測定時能快速分層，且吸光度增加，從而使檢測靈敏度提高。

取1.3.1 方法制備的石斛汁（如有濾渣，過濾得清汁）10 mL，加入200 μL 氨水充分振搖后靜置10 min，加入7 mL 氯仿渦旋1 min，于37 ℃水浴浸提40 min；取氯仿提取液6 mL，后續(xù)操作同標準曲線。于620 nm檢測吸光度，對照標準曲線及石斛鮮條的加水比例得到石斛汁中總生物堿溶出量（以石斛堿計）[21]，這里稀釋度6/7。溶出量指1 g 石斛鮮條中溶出總生物堿微克數(shù)，單位以μg/g 表示。

1.3.3 石斛汁中總生物堿溶出量單因素試驗

1.3.3.1 鮮條預處理的影響

鮮條一般冷藏或凍藏保存，研究（整）鮮條直接榨汁以及切段至1 cm 后冷藏或凍藏榨汁。5 g～10 g 整鮮條（或切段）加入 30 倍純凈水（g/mL）（pH 7.0～7.2），水溫 20 ℃左右，榨汁時間 1 min（30 s+30 s，以下同），過濾除去濾渣，測定石斛汁中總生物堿溶出量。

1.3.3.2 榨汁過程各因素影響

加水比例：取冷凍后的石斛段約5 g，加入30、40、50、60 倍純凈水榨汁，水溫20 ℃左右，榨汁時間 1 min，過濾后測定。

水溫：冷凍后的石斛段約5 g，加入30 倍純凈水榨汁，水溫分別為 20、30、40、50、60 ℃，榨汁時間 1 min，過濾后測定。

pH 值：冷凍后的石斛段約5 g，加入30 倍溫度為40 ℃酸水（純凈水加入檸檬酸-檸檬酸鈉調(diào)節(jié)）榨汁，水 pH 值分別為 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，榨汁時間 1 min，過濾后測定。

1.3.3.3 超聲波作用的影響

超聲功率：取石斛汁（按1.3.3.2 較優(yōu)條件制備）置于 200、300、400、500 W 超聲波處理 5 min，過濾，測定。

超聲時間：取石斛汁（按1.3.3.2 較優(yōu)條件制備）置于功率 400 W 的超聲波中分別作用 0、5、10、15、20 min，過濾，測定。

1.3.3.4 殺菌及貯藏過程影響

取較優(yōu)條件下（由1.3.3.3 確定）制備的石斛汁，依次離心過濾（5 000 r/min、10 min）、脫氣（0.08 MPa～0.1 MPa，3 min～5 min）、均質(zhì)（15 MPa～20 MPa，5 min）處理后，抽真空包裝，80 ℃巴氏殺菌30 min，抽樣進行微生物及總生物堿溶出測定。殺菌后的石斛汁置于冰箱冷藏（4 ℃～6 ℃），每周監(jiān)測微生物及生物堿溶出變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗結(jié)果以平均值±標準差表示，每組3 個平行試驗，顯著性分析采用SPSS 19.0 分析軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛中總生物堿含量測定

采用95%EtOH、75%酸性乙醇及氨水氯仿對鐵皮石斛提取后，其總生物堿含量測定分別為：69.3、58.6、19.6 μg/g，以 95%EtOH 提取的總生物堿含量最高，其為堿性氯仿提取效果的3.13 倍，而金釵石斛藥材中總生物堿含量測定通常以氯仿萃取法進行[22]，推測鐵皮石斛中總生物堿種類應(yīng)與金釵石斛中以石斛堿為主的組成相差較大。于是對3 種提取方式下鐵皮石斛總生物堿組成進行HPLC 檢測，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同溶劑提取鐵皮石斛總生物堿的HPLC 疊加圖Fig.1 The HPLC spetra of crude alkaloids extracted from Dendrobium officinale

由圖1 可知，盡管堿性氯仿與95%乙醇提取的總生物堿含量相差3 倍之多，但兩者提取出的生物堿種類基本類似，但這些主要種類中并未發(fā)現(xiàn)石斛堿（石斛堿標品出峰時間為8.6 min）。因此，鐵皮石斛中總生物堿組成類別區(qū)別于金釵石斛，該種類藥材中總生物堿含量以95%乙醇提取下69.3 μg/g 作為基準可能更合理。

2.2 鮮條預處理對石斛汁生物堿溶出量影響

鮮條經(jīng)過切段（1 cm）或冷凍預處理后所制得石斛汁中總生物堿溶出結(jié)果列于圖2。

圖2 預處理對石斛汁生物堿溶出量影響Fig.2 Effect of pretreatment methods on total alkaloids dissolution in Dendrobium officinale juice

由圖2 可知，石斛（整）鮮條加30 倍水高速破碎榨汁，其汁液中總生物堿溶出量為5.26 μg/g，與藥材中總生物堿含量（69.3 μg/g）相比得到它的溶出率為7.59%；金釵石斛飲片熬煮7 h 的生物堿累積溶出率也僅15%[23]，推測這與鐵皮石斛部分生物堿有一定水溶性有關(guān)。而鮮條經(jīng)過切段及冷凍處理后，其石斛汁中生物堿溶出量較常規(guī)榨汁（即整鮮條加水榨汁）提高了17.30 % [（6.17±0.11）μg/g→（5.26 ± 0.12）μg/g，P ＜0.05]，這也說明冷凍預處理有助于植物細胞破壁，最終促使了有效成分在壓榨汁中的溶出[24]，后續(xù)的榨汁試驗均選用切段1 cm 且冷凍后的鮮條進行。

2.3 榨汁過程各因素對石斛汁總生物堿溶出量影響

榨汁過程各因素水平對石斛總生物堿溶出量影響見表1。

表1 榨汁過程各因素水平對石斛總生物堿溶出量影響Table 1 Effect of various factors in squeezing process on total alkaloids dissolution

一般來說，藥材中活性成分溶出增加將促使其保健功效提升[25]。深入研究石斛在榨汁過程中各因素（加水比例、水溫、pH 值等）對總生物堿溶出影響，這對石斛的高效利用及石斛汁保健產(chǎn)品開發(fā)具有重要參考價值。石斛鮮條加水榨汁預試驗表明：當加水比例達1 ∶30（g/mL）以上時，其石斛汁液黏稠度宜于壓榨過程進行。由表1 可知，隨著加水量由30倍增至50 倍（g/mL）時，石斛汁中生物堿溶出量并未增加，這可能因為生物堿在水中的溶解度很有限?？紤]到石斛汁中生物堿濃度（μg/mL）高便于后續(xù)檢測，以下研究將加水比例限定在1 ∶30（g/mL）。接下去，研究了榨汁水溫對生物堿溶出的影響。當水溫由20 ℃增加至40 ℃，其生物堿溶出量略有增加 [（6.15±0.09）μg/g→（6.42±0.12）μg/g，P ＞ 0.05]；而當水溫達 60 ℃時，其溶出量相比40 ℃時則降低12.9%。另外，考慮到生物堿具弱堿性，其在酸性條件下成鹽可能會增加其在水中溶解度；更為重要的是，酸性條件下微生物不易繁殖，對后續(xù)石斛汁殺菌更為有利。故此，采用檸檬酸-檸檬酸鈉調(diào)整了純凈水pH 值。當榨汁水溫40 ℃、pH 值在4.0左右時，其生物堿溶出量較中性條件（pH7.0～7.2）時增加 5.80%（pH 4.0～4.5→pH 7.0，P ＞ 0.05）。盡管增加量并不顯著，但考慮到酸性環(huán)境對后續(xù)殺菌的便利性，石斛榨汁宜選擇40 ℃、pH 4.0 的酸水進行，這與總生物堿提取所用酸性乙醇選擇pH 值為3 略有出入[12]。

綜上所述，石斛鮮條切段冷凍處理后加入30 倍pH 4、溫度40 ℃的水進行榨汁，其生物堿溶出量可達到6.77（μg/g），與日常生活中的常規(guī)榨汁法（圖2，整鮮條）則可提高28.71%。

2.4 超聲處理對石斛汁總生物堿溶出量影響

超聲波處理有助于植物組織中活性成分溶出，如石斛中多糖、南瓜中葉黃素及蘋果渣中多酚物質(zhì)等[15，26-27]。對2.3 中制備的石斛汁輔以超聲波作用后，其生物堿溶出有明顯提高，結(jié)果見圖3。

當超聲功率由200 W 增加至400 W，生物堿溶出量逐步增加，在400 W/5 min 時溶出量較對照組相比提高37.00%（P ＜0.01）；若功率繼續(xù)增加至500 W 或600 W，生物堿溶出量則呈現(xiàn)下降趨勢，由400 W 時9.22 μg/g 下降至 8.28、7.17 μg/g，故在較適功率 400 W下，又研究了超聲時間對生物堿溶出量影響。當超聲時間由5 min 延長至10 min 時，其生物堿溶出量提高11.55 %[（9.18±0.11）μg/g →（10.24±0.17）μg/g，P ＜0.05]，此時的溶出量與對照組相比增加52.15%。若繼續(xù)延長超聲時間至15 min 或20 min，生物堿溶出量則呈現(xiàn)逐步降低趨勢，這與超聲時間增加會造成石斛多糖得率降低的現(xiàn)象類似[15]。超聲處理后石斛汁有升溫現(xiàn)象（40 ℃→70 ℃～80 ℃），研究發(fā)現(xiàn)水溫升高（表1，40 ℃→60 ℃）也造成了生物堿溶出量降低，推測超聲時間延長所致溶出量降低應(yīng)該與高溫降解有關(guān)。

圖3 超聲波處理對石斛汁生物堿溶出量影響Fig.3 Effect of ultrasonication on total alkaloids dissolution in Dendrobium officinale juice

2.5 殺菌及貯藏對石斛汁生物堿溶出量影響

本研究確立了富含生物堿的石斛汁制備方案，即鮮條切段冷凍預處理后加30 倍pH 4、40 ℃水進行榨汁，且輔以400 W 超聲波處理10 min，這些措施使石斛汁中生物堿溶出量[（10.24±0.17）μg/g]較常規(guī)榨汁提高94.68 %，此時石斛中總生物堿溶出率則達到14.81%。然而，商品化的石斛汁產(chǎn)品必須要經(jīng)過殺菌處理后方可流通，因此，我們對石斛汁進行巴氏殺菌，并對殺菌石斛汁貯存時微生物變化及生物堿溶出量進行考察，結(jié)果列于表2、圖4。

表2 石斛汁殺菌及貯藏過程中微生物變化Table 2 Microbial changes of Dendrobium officinale juice during sterilization and storage period

圖4 殺菌處理及貯藏過程對石斛汁中生物堿溶出量的影響Fig.4 Effect of sterilization and storage on total alkaloids dissolution in Dendrobium officinale juice

由表2 可知，未殺菌時鐵皮石斛汁中微生物數(shù)量并不多[19]，這與榨汁時采用的酸性條件抑制了微生物生長有關(guān)。相比之下，巴氏殺菌可有效殺滅石斛汁中的微生物，其菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌、大腸菌群均符合GB 7101-2015《食品安全國家標準飲料》微生物限量要求；同時，石斛汁經(jīng)巴氏殺菌處理后，其生物堿溶出量（殺菌0 周）較未殺菌者僅降低8.00 % [（10.19±0.15）μg/g→（9.37±0.18）μg/g，P ＞ 0.05]，結(jié)果見圖4。已殺菌的石斛汁于4 ℃冷藏避光貯存，至第4 周時，其菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)量開始有一定程度繁殖；第7周時，部分批次樣品的菌落總數(shù)、霉菌、酵母菌已接近臨界值（100、20、20 CFU/mL），此時大腸菌群仍未檢出。上述研究表明：石斛汁經(jīng)80 ℃巴氏殺菌處理30 min，其微生物繁殖可得到較好抑制，其可在4 ℃避光下貯存6 周～7 周。與此同時，隨著貯藏期延長，石斛汁中生物堿溶出量呈緩慢下降趨勢，第4 周時的溶出量相比0周時降低6.01%[（9.37±0.18）μg/g →（8.81±0.20）μg/g]；即使被貯存7 周，石斛汁中生物堿溶出量仍高于常規(guī)石斛汁52.47 %[（8.02±0.19）μg/g→（5.26±0.12）μg/g，P ＜ 0.01]。

3 結(jié)論與討論

1）石斛汁中生物堿溶出量受鮮條預處理方式及超聲波輔助作用影響較大，鮮條切段且冷凍預處理后榨汁，其生物堿溶出較常規(guī)榨汁提高17.30 %[（5.26±0.12）μg/g→（6.17±0.11）μg/g]；石斛汁輔以 400 W 超聲波處理10 min，其生物堿溶出又提高52.15 %[（6.73±0.11）μg/g→（10.24±0.17）μg/g]。榨汁時調(diào)節(jié)水溫及pH 值對生物堿溶出量提升效果不明顯，但對后續(xù)殺菌有利。

2）巴氏殺菌（80 ℃，30 min）可有效抑制石斛汁微生物繁殖，但也使生物堿溶出降低8.00 %；石斛汁在4 ℃避光下貯存可達6 周～7 周，貯藏過程中生物堿溶出有逐漸降低趨勢，但貯存7 周的石斛汁中生物堿溶出量仍遠高于常規(guī)石斛汁52.47%（8.02±0.19）μg/g→（5.26±0.12）μg/g，P ＜ 0.01]。這說明該加工方法使石斛汁中生物堿穩(wěn)定保存，從而有望提升其保健功效。

3）日常生活中自制石斛汁的方法，其石斛資源利用度不高；適當?shù)募庸ぬ幚砜捎行岣呋钚猿煞值睦脙r值，因此，石斛汁深加工勢在必行。