農(nóng)家凍菜亞硝酸鹽含量變化規(guī)律的研究

賈慶超，游新俠

（鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450064）

蔬菜可提供人類(lèi)生命所需的多種維生素、纖維素和微量礦物質(zhì)[1]等。同時(shí)蔬菜又是容易富集硝酸鹽的植物，人體攝入的硝酸鹽81.2%以上來(lái)自蔬菜[2]。雖然硝酸鹽本身對(duì)人體危害不大，但在微生物（硝酸還原酶）的作用下可還原為亞硝酸鹽[3]。亞硝酸鹽是氧化性毒物[4]，過(guò)多的亞硝酸鹽被吸進(jìn)人體后，將正常的血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，血紅蛋白內(nèi)的鐵由Fe2+變成Fe3+，失去攜氧能力，還會(huì)阻止正常氧合血紅蛋白放出氧，導(dǎo)致組織缺氧[5]，另一方面亞硝酸鹽對(duì)人體的危害還在于它在特定條件下（環(huán)境酸堿度、微生物菌群和適宜的溫度）可能轉(zhuǎn)化為亞硝胺。亞硝胺是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)[6]，從而誘發(fā)消化系統(tǒng)癌癥的發(fā)生[7]。但我國(guó)目前對(duì)肉類(lèi)制品中亞硝酸鹽含量問(wèn)題較為重視，而蔬菜中存在的亞硝酸鹽則常被人們所忽視[7]。一般來(lái)說(shuō)，日常情況下蔬菜中硝酸鹽不會(huì)引起中毒。但蔬菜存放過(guò)程中，硝酸鹽在微生物的作用下會(huì)被還原成亞硝酸鹽，當(dāng)亞硝酸鹽富集到較高濃度時(shí)，食用后可引起中毒[8]，蔬菜在新鮮狀態(tài)下，硝酸鹽無(wú)顯著變化，亞硝酸鹽含量極低，如果存放條件差、時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)菌就會(huì)大量繁衍，這時(shí)亞硝酸鹽含量會(huì)明顯激增[9]，并且亞硝酸鹽含量隨放置時(shí)間而變化[10]。選擇具有代表性的葉菜類(lèi)、根菜類(lèi)、莖菜類(lèi)蔬菜，經(jīng)過(guò)預(yù)處理，加鹽提高環(huán)境密度，使得不利于細(xì)菌增長(zhǎng)，在低溫條件下儲(chǔ)存冷凍蔬菜，模擬農(nóng)家日常生活中人們儲(chǔ)存和加工蔬菜方式。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)于農(nóng)家凍菜中亞硝酸鹽含量方面的研究目前還處于空白狀態(tài)，因此，研究自制凍菜亞硝酸鹽含量隨時(shí)間變化規(guī)律將具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文采用分光度法-格林斯試劑比色法，采用最大吸收波長(zhǎng)下（538 nm）[11]，模擬日常生活中凍菜加工方法，對(duì)自制凍菜亞硝酸鹽含量隨時(shí)間變化規(guī)律研究，為人們?cè)趦霾说暮侠韮?chǔ)存、加工、食用中提供科學(xué)的參考根據(jù)[12-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大白菜、水晶白蘿卜、苤藍(lán)、芹菜：市購(gòu)。

亞鐵氰化鉀、硼酸鈉、鹽酸、氨水、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、乙酸鋅、正辛醇、冰乙酸、活性炭（粉狀）、亞硝酸鈉，均為分析純：鄭州派尼化學(xué)試劑廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-4802 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；HH-S 型水浴鍋：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；BS224S 型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；BCD-206STPA 型冰箱：青島海爾股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

將購(gòu)買(mǎi)的新鮮蔬菜取可食部分可先用自來(lái)水、再用蒸餾水洗凈，后用濾紙吸干蔬菜表面的水分后，每種蔬菜約取700 g，切成厚0.8 mm 左右、寬1 cm～1.2 cm的長(zhǎng)條或3 cm～4 cm 的片狀，將每種蔬菜用保鮮盒裝好，并在保鮮盒上標(biāo)注相應(yīng)的標(biāo)簽，以便于識(shí)別樣品。根據(jù)低鹽度鹽漬和低溫環(huán)境下可以有利于抑制微生物的生長(zhǎng)[14]，根據(jù)口味添加食用鹽，其蔬菜加鹽的鹽濃度控制在0.016 g/g，溫度控制在1 ℃左右下在冰箱內(nèi)冷藏備用。定時(shí)稱(chēng)取適量的4 組蔬菜樣品組織，將樣品切碎，充分混勻后用四分法取5.000 g。在取好的樣品中加1 滴～2 滴正辛醇消除泡沫劑，并置于250 mL具塞錐形瓶中，加入12.5 mL 飽和硼砂溶液，后加入70 ℃左右的純凈水150 mL，混勻，于水浴鍋中沸水浴15 min 左右，取出，冷水浴后，冷卻至室溫。加入5 mL亞鐵氰化鉀（106 g/L）溶液，充分混勻，再加5 mL 乙酸鋅（220 g/L）溶液以沉淀蛋白質(zhì)，然后加入1 g 活性炭用水定容到刻度，搖勻，放置0.5 h 左右，上清液用定量濾紙過(guò)濾，濾液必須清澈（棄去初濾液30 mL）供測(cè)定用。在 0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、15、17、19、21、24、27、30 d 取樣測(cè)定其亞硝酸鹽的含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2 次，取其樣品平均值，同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)（不加樣品），根據(jù)試驗(yàn)條件采用GB 5009.33-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》測(cè)定凍菜中亞硝酸鹽含量[15]。

1.4 亞硝酸鹽含量的計(jì)算

分別精確吸取已配制的0.5 μg/mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液 0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于一組 50 mL帶塞比色管中，先加入適量的純凈水稀釋?zhuān)靹?，再用移液槍分別往帶塞比色管中分別加入2 mL 對(duì)氨基苯磺酸（4 g/L）溶液，搖勻靜置約 3 min～5 min，再加入1 mL 鹽酸萘乙二胺（2 g/L）溶液，用水稀釋到刻度，混勻，在暗處放置15 min 后，用零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，用1 cm比色皿在538 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定亞硝酸鹽吸光度，繪制測(cè)得的各比色液的吸光度與對(duì)應(yīng)的亞硝酸鹽濃度曲線(xiàn)圖。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，樣品中亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計(jì)）的含量，計(jì)算公式如下：

式中：X 為試樣中亞硝酸鹽的含量，mg/kg；m1為測(cè)定用樣液中亞硝酸鹽的質(zhì)量，μg；1 000 為轉(zhuǎn)換系數(shù)；m2為試樣的質(zhì)量，g；V1為測(cè)定用樣液體積，mL；V0為試樣處理液總體積，mL。

根據(jù)GB 2762-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》對(duì)于蔬菜類(lèi)食品規(guī)定中，亞硝酸鹽含量不得超過(guò)20 mg/kg[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

測(cè)定亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液亞硝酸鹽含量，結(jié)果見(jiàn)表1所示。

表1 亞硝酸鹽質(zhì)量與吸光度關(guān)系Table 1 Relationship between the quality of nitrite and absorbance

根據(jù)表1 數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如下圖1所示。

圖1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard nitrite curve

根據(jù)圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性回歸方程Y=0.089 2x+0.000 2（Y 為吸光度，x 為亞硝酸鈉質(zhì)量（μg），線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，表明數(shù)據(jù)與直線(xiàn)之間的相關(guān)程度較好，因此可以可以滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。

2.2 亞硝酸鹽含量的測(cè)定

大白菜、水晶白蘿卜、苤藍(lán)、芹菜4 種自制凍菜樣品在冷溫（1 ℃）條件下冰箱儲(chǔ)存30 d，每天對(duì)4 種樣品進(jìn)行取樣，測(cè)定和分析其亞硝酸鹽含量，測(cè)定結(jié)果如表2所示。

從表2 中可以看出幾組蔬菜在新鮮狀況下，亞硝酸鹽含量都是比較低的，自制凍菜在1 d～7 d 亞硝酸鹽含量增加速度非常緩慢，這是因?yàn)閬喯跛猁}含量受到溫度和鹽度的影響，提高了自制凍菜滲透壓、降低了自制凍菜水分的活度、有選擇地抑制其他微生物的生長(zhǎng)[16-17]，使自制凍菜體內(nèi)的亞硝酸鹽生成的速度極為緩慢，因此，低溫和加鹽對(duì)抑制亞硝酸鹽升高有一定的作用。大概從11 d～17 d 內(nèi)均出現(xiàn)了峰值，這是因?yàn)殡S著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，其中的微生物還是可以生長(zhǎng)的，其細(xì)菌就會(huì)大量繁衍，使亞硝酸鹽含量升高。隨著貯存時(shí)間越長(zhǎng)，增加越為顯著，而在17 d～30 d 又出現(xiàn)了亞硝酸鹽含量不同程度的下降并逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)。這是因?yàn)殡S著微生物的生長(zhǎng)代謝和繁殖等活動(dòng)的不斷進(jìn)行使保鮮盒內(nèi)的氧氣被逐漸慢慢的消耗殆盡，不利于微生物及酶類(lèi)生長(zhǎng)繁殖[18]，亞硝酸鹽含量升高到一定的程度后，逐漸下降并趨于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的數(shù)值。

表2 凍菜亞硝酸鹽含量隨冷藏時(shí)間對(duì)變化規(guī)律的研究Table 2 Time dependence of frozen vegetables

圖2 凍菜亞硝酸鹽含量隨時(shí)間變化曲線(xiàn)Fig.2 Time dependence of frozen vegetables

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 加標(biāo)回收率

本試驗(yàn)是以水晶白蘿卜為例，選擇3 個(gè)樣品在其過(guò)濾的消化液中分別添加0.6、0.8、1mL 的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，用純凈水定容到50 mL 比色管中，本試驗(yàn)采用的是標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定亞硝酸鹽回收率，以此表示試驗(yàn)的準(zhǔn)確度和可靠性。試驗(yàn)結(jié)果如表3。

表3 試驗(yàn)回收率測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of recovery rate

由表可知，3 個(gè)不同加標(biāo)量樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，測(cè)得亞硝酸鹽的回收率分別為95%、90%、94%，平均回收率為93%，回收率越接近1，說(shuō)明樣品消解的損失率越低，試驗(yàn)方法準(zhǔn)確度越高。因此在采用紫外分光光度法過(guò)程中不存在顯著系統(tǒng)誤差，方法準(zhǔn)確性具有較高的可信度。

2.3.2 精密度測(cè)定

配置1 μg/mL 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，利用移液槍準(zhǔn)確移取1 mL 的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞比色管內(nèi)，按照重氮偶合法使用紫外分光度計(jì)對(duì)樣品對(duì)標(biāo)樣重復(fù)測(cè)定7 次，計(jì)算吸光度的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)平均偏差，可以來(lái)確定儀器的準(zhǔn)確度和靈敏度，以此確定試驗(yàn)的可靠性，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of precision test

由表中精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果可知，通過(guò)重復(fù)測(cè)定標(biāo)樣7 次，計(jì)算樣品標(biāo)樣吸光度的重復(fù)性，樣品標(biāo)樣吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.597%，遠(yuǎn)小于2%，表明試驗(yàn)精密度測(cè)定結(jié)果完全可以滿(mǎn)足試驗(yàn)精密度的要求，試驗(yàn)準(zhǔn)確度較好。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)4 種不同類(lèi)型自制凍菜亞硝酸鹽含量的測(cè)定，結(jié)果表明：冷藏0～30 d 時(shí)亞硝酸鹽含量分別為，芹菜 0.474 mg/kg～1.193 mg/kg、苤藍(lán) 0.494 mg/kg～0.82 mg/kg、水晶白蘿卜 0.489 mg/kg～1.057 mg/kg、大白菜0.523 mg/kg～0.496 mg/kg，亞硝酸鹽含量最高的天數(shù)為15、17、17、11 d，整體峰值比新鮮蔬菜大約晚一周左右的時(shí)間。農(nóng)家凍菜亞硝酸鹽含量增長(zhǎng)速率隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，達(dá)到峰值后亞硝酸鹽含量會(huì)逐漸降低。隨著冷藏時(shí)間的持續(xù)延長(zhǎng)亞硝酸鹽含量不斷降低直到趨于穩(wěn)定狀態(tài)。試驗(yàn)的回收率為93%，試驗(yàn)方法準(zhǔn)確度高，其精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)平均偏差為0.597%，遠(yuǎn)小于2%，表明精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果完全可以滿(mǎn)足試驗(yàn)精密度的要求。根據(jù)GB 2762-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》對(duì)于蔬菜類(lèi)食品規(guī)定亞硝酸鹽含量不得超過(guò)20 mg/kg，食用對(duì)人體健康不會(huì)造成影響。