添加苦蕎黃酮提取物的裸燕麥擠壓膨化產(chǎn)品抗氧化及降血脂功效研究

薛朕鈺，薛淼，王雪，王聰，肖萍，2，王步江，2，劉金福，2，*

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384）

裸燕麥本身含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，諸如優(yōu)質(zhì)球型顆粒蛋白質(zhì)、各種不飽和脂肪酸、各種可溶和不可溶纖維素和豐富的礦物質(zhì)；燕麥中β-葡聚糖含量較高，可有效改善糖尿病腎病大鼠腎臟功能，延緩腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷[1-3]。燕麥中黃酮含量較低，游離型含量變幅為 128.83 μg RE/g～286.83 μg RE/g，結(jié)合型含量范圍在65.64 μg RE/g～123.05 μg RE/g，不同品種的燕麥中多酚組成存在差異顯著[4]。而苦蕎中含有豐富的生物類黃酮化合物，其主要成分為蘆丁，具有多種生理功能，如抗氧化、降血糖、降血脂和降膽固醇等作用[5]。

通過(guò)前期試驗(yàn)確定了擠壓膨化工藝參數(shù)[6]，添加苦蕎黃酮提取物來(lái)增強(qiáng)裸燕麥擠壓膨化產(chǎn)品的抗氧化能力，為開發(fā)生產(chǎn)具有抗氧化、降血脂等生物功效的燕麥膨化食品或食品配料提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

裸燕麥：產(chǎn)地為內(nèi)蒙古呼和浩特市；精制玉米淀粉（直鏈淀粉含量約為70%）：天津中英保健食品有限公司；苦蕎黃酮提取物（蘆丁含量為82.92%）：內(nèi)蒙古通遼市開魯縣昶輝生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

SPF 級(jí)雄性昆明小鼠、高脂飼料（含78.8%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.2%膽鹽）、基礎(chǔ)飼料：中國(guó)食品藥品檢定研究院；膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）：英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司。

DSE-30 雙螺桿擠壓膨化機(jī)：濟(jì)南鼎潤(rùn)機(jī)械設(shè)備有限公司；UV-1200 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；pH 酸度計(jì)：奧豪斯儀器有限公司；Elmasonic P180H 超聲波清洗機(jī)：德國(guó)Elma Schmid bauer 公司；MD3000 魅力全自動(dòng)生化儀：美國(guó) MD 儀器公司；GM505K 血糖分析儀：湖南可孚醫(yī)療用品有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 擠壓膨化產(chǎn)品的制備

以裸燕麥與玉米淀粉混合為原料，采用DSE-30雙螺桿高溫?cái)D壓膨化技術(shù)，螺桿轉(zhuǎn)速設(shè)定為25 Hz，喂料速度40 g/min，選用直徑為5.0 mm 的模口，物料加水量4%、IV 區(qū)膨化溫度180 ℃、燕麥與玉米淀粉的質(zhì)量比4 ∶6，進(jìn)行生產(chǎn)制備。以上述方法在燕麥與玉米淀粉混合原料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的苦蕎黃酮提取物，按照上述工藝條件進(jìn)行膨化，得到了強(qiáng)化苦蕎黃酮的擠壓膨化產(chǎn)品。

1.2.2 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

據(jù)DPPH 自由基溶液的質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系，得到線性方程：y=0.263 3x-0.001 2，R2=0.999 6，RSD=0.96%。

圖1 DPPH 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 DPPH standard curve

1.2.2.2 燕麥膨化產(chǎn)品的DPPH 自由基清除能力測(cè)定方法

取兩支試管，一支加入2 mL DPPH 溶液和2 mL待測(cè)樣品溶液；另一支試管中加入2 mL DPPH 溶液和2 mL 超純水，混合均勻后，靜置 30 min，在 517 nm 處測(cè)其吸光度。重復(fù)3 次，取平均值。

待測(cè)樣品經(jīng)過(guò)與DPPH 自由基作用后，DPPH 自由基的剩余量可由下式得到：

DPPH 自由基剩余量/%=（DPPH 自由基 t/DPPH自由基 0）×100[7]

式中：DPPH 自由基0 為0 時(shí)刻體系中DPPH 自由基的起始質(zhì)量濃度，mg/mL；DPPH 自由基t 為t 時(shí)刻體系中DPPH 自由基的質(zhì)量濃度，mg/mL；以100%減去DPPH 自由基的剩余含量，即為樣品對(duì)DPPH 自由基的清除率。

1.2.3 羥基自由基清除能力的測(cè)定方法

在試管中先后加入6 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液2 mL，待測(cè)樣品2 mL，6 mmol/L 的過(guò)氧化氫溶液2 mL，搖勻，靜置10 min，接著加入6 mmol/L 的水楊酸溶液2 mL，搖勻，放置在37 ℃的水浴鍋中加熱30 min，然后取出試管，在510 nm 處測(cè)得吸光度值（Ai），另取2 支試管，分別做空白（Ac）和樣品對(duì)照（Aj）。

待測(cè)樣品對(duì)羥自由基的清除率按照下列公式計(jì)算：清除率/%=1-（Ai-Aj）/Ac×100

1.2.4 鐵離子還原能力測(cè)定方法

取一支試管，加入1 mL 的待測(cè)樣品，再加入1 mL質(zhì)量濃度為1%的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后，放入50 ℃水浴鍋中水浴20 min，急速冷卻后，在3 000 r/min離心10 min，然后取上清液1 mL，加入1 mL 蒸餾水和200 μL 的氧化鐵溶液。另取一支試管做對(duì)照試驗(yàn)。在700 nm 處測(cè)得吸光度值。吸光度值越大表明對(duì)鐵離子的還原能力越強(qiáng)[8]。

1.2.5 高脂動(dòng)物模型建立和分組及血清指標(biāo)測(cè)定

40 只健康SPF 級(jí)雄性昆明小鼠，體重15 g～20 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為5 組，每組8 只。分別為空白對(duì)照組（CK）、高脂模型陽(yáng)性對(duì)照組（AC）、未加黃酮膨化組（WJH）、添加黃酮膨化組（TJH）、苦蕎黃酮提取物組（KH）?？瞻讓?duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，其余各組飼喂高脂飼料4 周建立高脂小鼠模型后，高脂模型組與苦蕎黃酮組繼續(xù)飼喂高脂飼料，未加黃酮膨化組飼喂燕麥膨化食品，添加黃酮膨化組飼喂苦蕎黃酮強(qiáng)化膨化食品（蘆丁含量為0.613%）。

空白對(duì)照組、高脂模型組、無(wú)黃酮膨化組、添加黃酮膨化組給予蒸餾水灌胃4 周，苦蕎黃酮組給予400 mg/kg 苦蕎黃酮提取物灌胃4 周。

血清指標(biāo)測(cè)定：末次灌胃后禁食12 h，乙醚麻醉后，摘眼球取血，所取血液4 ℃靜置20 min，4 000 r/min離心20 min，吸出上清液即為血清，采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定 TC、TG、HDL、LDL 的含量。

葡萄糖耐量（oral glucose tolerance test，OGTT）實(shí)驗(yàn)：末次給藥后禁食12 h，尾部取血用血糖儀測(cè)定空腹血糖值（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），然后各組經(jīng)口給予葡萄糖 2.5 g/kg，測(cè)定灌胃葡萄糖后 0、0.5、1、2 h 的血糖值。并按下式方法分別計(jì)算血糖下面積（AUC）[9]。

血糖下面積（AUC）=（空腹血糖+0.5 h 血糖值）×0.5/2+（0.5 h 血糖值+1 h 血糖值）×0.5/2+（1 h 血糖值+2 h 血糖值）/2 1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)組間t 檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除DPPH自由基的能力

樣品的DPPH 自由基清除率見(jiàn)表1。

表1 樣品DPPH 自由基清除率Table 1 DPPH scavenging rate of samples

由表1 可知膨化前原料和膨化后產(chǎn)品的DPPH 自由基清除率相近，約為40.86%，其起到抗氧化作用的可能主要為燕麥本身含有的β-葡聚糖、多酚類物質(zhì)等，添加1%苦蕎黃酮提取物后，DPPH 自由基清除率顯著上升，與膨化前原料相比增長(zhǎng)了72.34%，說(shuō)明強(qiáng)化苦蕎黃酮類物質(zhì)在抗氧化功效方面作用顯著。

2.2 清除羥自由基的能力

樣品對(duì)羥自由基清除能力如圖2所示。

圖2 羥基自由基清除率Fig.2 Hydroxyl radical scavenging rate

膨化前原料對(duì)羥自由基的清除率為51.45 %，膨化后產(chǎn)品對(duì)羥基自由基的清除能力有所降低，抗氧化活性受到影響。添加1%苦蕎黃酮提取物的燕麥膨化產(chǎn)品對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到88.33%，進(jìn)一步證實(shí)了膨化產(chǎn)品中添加黃酮類化合物可顯著增強(qiáng)清除羥自由基的能力，提高抗氧化活性。

2.3 三價(jià)鐵離子的還原能力

樣品對(duì)鐵離子還原能力的測(cè)定如圖3所示。

圖3 鐵離子的還原能力測(cè)定Fig.3 Determination of iron ion reduction

通過(guò)原料及產(chǎn)品對(duì)鐵離子還原能力的測(cè)定，在700 nm 處測(cè)得4 種樣品的吸光度大小排列為：添加1%苦蕎黃酮膨化產(chǎn)品＞膨化前原料＞膨化后產(chǎn)品。吸光度越高代表對(duì)三價(jià)鐵還原能力越高，說(shuō)明添加苦蕎黃酮提取物對(duì)燕麥膨化食品抗氧化能力有顯著提升。

2.4 高脂動(dòng)物模型血脂4 項(xiàng)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析

小鼠灌胃前后攝食量、飲水量和體重指標(biāo)如圖4～6所示。

圖4 灌胃后各組小鼠攝食量變化Fig.4 Change of food intake in mice after gavage

圖5 各組小鼠飲水量變化Fig.5 Changes of water content in each group mice

圖6 各組小鼠體重變化Fig.6 Changes of body weight in each group mice

試驗(yàn)中空白對(duì)照組灌胃后攝食量穩(wěn)定水平，趨于中間水平；未加黃酮膨化組更換飼料前飲水量較大趨于平穩(wěn)狀態(tài)且更換飼料后飲水量有所降低后趨于平穩(wěn)；更換飼料前小鼠體重呈上升趨勢(shì)至最高體重51.42g，更換飼料后小鼠體重平穩(wěn)下降狀態(tài)；添加黃酮膨化組更換飼料前飲水量平穩(wěn)且更換飼料后飲水量有所提升后呈上下波動(dòng)形態(tài)，更換飼料前小鼠體重呈上升趨勢(shì)，體重增長(zhǎng)迅速，更換飼料后呈平穩(wěn)下降趨勢(shì)后逐漸趨于平穩(wěn)狀態(tài)；苦蕎黃酮組灌胃前小鼠飲水量較大，灌胃后迅速降低，且呈波動(dòng)狀態(tài)略有提升，灌胃前小鼠體重逐漸升高后趨于平穩(wěn)，灌胃后小鼠體重略有降低，但體重依然較高且保持平穩(wěn)狀態(tài)。

小鼠血清指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 各組小鼠脂代謝相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（，n=6）Table 2 The lipid metabolism parameter of rats in each group（，n=6）

表2 各組小鼠脂代謝相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（，n=6）Table 2 The lipid metabolism parameter of rats in each group（，n=6）

注：同一列肩注字母不同表示組間有顯著差異P＜0.05，含有相同字母表示組間無(wú)顯著差異P＞0.05。

組別 TG/（mmol/L） TC/（mmol/L） HDL/（mmol/L）LDL/（mmol/L）CK 0.81±0.07c 2.63±0.28c 2.34±0.24c 0.20±0.11c AC 1.24±0.12a 4.39±0.23a 2.30±0.19b 0.74±0.08a TJH 0.80±0.05c 3.64±0.21b 3.75±0.20a 0.35±0.06bc WJH 1.11±0.14ab 4.18±0.16ab 3.64±0.15ab 0.55±0.06ab KH 0.94±0.14bc 4.57±0.45ab 3.63±0.32ab 0.63±0.05a

分析可知高脂模型組與空白對(duì)照組小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著性的差異（P<0.05），表明造模后的高脂小鼠糖脂代謝發(fā)生明顯紊亂。通過(guò)4 周提取物的灌胃與更換飼料后飼喂的TG、TC、HDL、LDL 指標(biāo)對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，添加黃酮膨化組與高脂模型組小鼠存在顯著性差異（P<0.05），其中TG 與 LDL 含量其與空白對(duì)照組小鼠相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明小鼠甘油三酯的代謝和低密度脂蛋白的水平恢復(fù)明顯，HDL 含量與空白對(duì)照組小鼠相比有所提升，說(shuō)明添加1%苦蕎黃酮提取物的擠壓膨化食品對(duì)高脂小鼠的糖脂代謝有積極的影響；未加黃酮膨化組的血脂4 項(xiàng)指標(biāo)與高脂模型組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05），但 TG、TC、LDL 含量指標(biāo)有所降低，HDL 含量有所升高，說(shuō)明燕麥擠壓膨化產(chǎn)品對(duì)小鼠血脂4 項(xiàng)水平也存在一定的影響，可能是因?yàn)楫a(chǎn)品中含有β-葡聚糖和抗性淀粉的作用。

2.5 高脂動(dòng)物模型葡萄糖耐量和血糖下面積

各組小鼠糖耐量的變化如圖7所示。

高脂模型組大鼠葡萄糖耐量與空白對(duì)照組相比有較為明顯的上升，血糖急劇上升，添加苦蕎黃酮提取物的擠壓膨化食品對(duì)小鼠糖耐量有較好的調(diào)節(jié)作用，血糖上升水平最低；未添加提取物的膨化產(chǎn)品組小鼠與空白對(duì)照的糖耐量相似，但血糖下降趨勢(shì)相對(duì)緩慢；

各組小鼠血糖下面積（AUC）的變化如圖8所示。

圖7 各組小鼠糖耐量的變化（，n=6）Fig.7 Changes of glucose tolerance in mice in each group（，n=6）

圖8 各組小鼠血糖下面積（AUC）的變化（，n=6）Fig.8 Changes of AUC in mice of each group（，n=6）

對(duì)各組小鼠的血糖下面積進(jìn)一步分析可知，加黃酮膨化組小鼠的血糖下面積顯著低于其余各組（P<0.05），未添加提取物組與添加提取物組小鼠的血糖下面積相近，與高脂模型組小鼠相比有所下降，程度不明顯，而添加組小鼠血糖下面積與空白對(duì)照組有顯著的降低（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

本研究前期試驗(yàn)對(duì)擠壓膨化原料、擠壓膨化前后黃酮類物質(zhì)含量的變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在一定的擠壓膨化條件下，黃酮類物質(zhì)有一定的損失，但并不十分顯著[6]，進(jìn)而可對(duì)強(qiáng)化黃酮類物質(zhì)的產(chǎn)品的生物活性作進(jìn)一步的研究。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)原料具有抗氧化能力，可能主要與燕麥中含有的β-葡聚糖、少量的多酚類物質(zhì)等有關(guān)，他們具有一定的抗氧化能力。通過(guò)DPPH 自由基清除率、羥基自由基清除率和三價(jià)鐵還原能力的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，添加苦蕎黃酮提取物后的擠壓膨化產(chǎn)品其抗氧化能力得到顯著提高。黃酮類化合物等的抗自由基活性與其結(jié)構(gòu)中的C 環(huán)C3 位的羥基基團(tuán)和B 環(huán)上的鄰位二羥基結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[10]，從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在高溫高壓擠壓膨化加工的條件下，羥基基團(tuán)還具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，保持了較高的清除自由基的能力。從Fe3+被還原為Fe2+的能力也可以看出，強(qiáng)化了苦蕎黃酮提取物的燕麥擠壓膨化產(chǎn)品的還原性、抗氧化活性得到明顯增強(qiáng)。

在高脂動(dòng)物模型對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)4 周提取物的灌胃與更換飼料喂養(yǎng)小鼠的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，未加黃酮膨化組的血脂4 項(xiàng)指標(biāo)中TG、TC、LDL 指標(biāo)有所降低。醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為β-葡聚糖具有清腸、調(diào)節(jié)血糖、降低膽固醇、提高免疫力4 大生理作用[11]。添加苦蕎黃酮提取物的擠壓膨化產(chǎn)品對(duì)高脂血癥小鼠的糖脂代謝有積極地影響，使得高脂血癥小鼠癥狀得到改善，調(diào)整了糖脂代謝機(jī)能，可能使其胰島、肝臟等器官的功能得到改善和恢復(fù)；而在糖耐量指標(biāo)中，苦蕎膨化組低于空白對(duì)照組模型但不顯著，而添加苦蕎黃酮組顯著低于空白對(duì)照組，可能是苦蕎黃酮提取物和燕麥β-葡聚糖均有降血脂的功效，從而進(jìn)一步降低了糖耐量指標(biāo)。前期試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，添加苦蕎黃酮提取物的產(chǎn)品淀粉結(jié)構(gòu)有所變化，抗性淀粉的含量有一定的增加，也可能是降低血脂水平的原因之一?？梢?jiàn)，利用擠壓膨化技術(shù)強(qiáng)化一定量的黃酮類物質(zhì)可以開發(fā)生產(chǎn)具有更強(qiáng)生物活性的食品。

燕麥和淀粉混合原料對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到41.06%、對(duì)羥自由基的清除率是51.45%；原料經(jīng)擠壓膨化后的膨化產(chǎn)品對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到40.68%、對(duì)羥自由基的清除率是48.53%；添加1%苦蕎黃酮提取物的燕麥擠壓膨化產(chǎn)品對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到70.76%、對(duì)羥自由基的清除率是88.33%；對(duì)三價(jià)鐵離子的還原能力分別為添加1%苦蕎黃酮膨化產(chǎn)品0.317、膨化前原料0.236、膨化后產(chǎn)品0.213。

添加苦蕎黃酮提取物的裸燕麥擠壓膨化產(chǎn)品對(duì)高脂血癥小鼠具有較好的糖脂代謝調(diào)節(jié)作用，在血脂指標(biāo)TG、HDL、HDL、LDL 中，加黃酮膨化組與高脂模型組存在顯著性差異（P＜0.05），其中 TG 與 LDL 含量與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異；HDL 含量有顯著性提升，其糖耐量與血糖下面積顯著優(yōu)于其余各組。以燕麥和淀粉為主要原料進(jìn)行擠壓膨化食品的生產(chǎn)中通過(guò)強(qiáng)化苦蕎黃酮提取物可顯著提高膨化產(chǎn)品的抗氧化能力，改善小鼠糖脂代謝紊亂效果更加明顯，此技術(shù)可用于生產(chǎn)具有更好生物功能的擠壓膨化食品或食品配料。