根癌農(nóng)桿菌D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶基因克隆、結(jié)構(gòu)預(yù)測及原核表達(dá)

朱星星， 楊培周， 杜明睿， 吳 蕓， 姜紹通

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院/安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工省級實(shí)驗(yàn)室， 安徽 合肥 230009)

作為一種自然界天然存在但含量極少的糖，D-阿洛酮糖屬于一種新型低熱量甜味劑，其甜度相當(dāng)蔗糖的70%，能量僅為蔗糖的0.3%[1-2]，D-阿洛酮糖還具有特殊的生理活性，包括預(yù)防肥胖[2-3]、降血糖[3-4]、降血脂[5]、抗氧化[4]、保護(hù)神經(jīng)[6]以及抑制癌細(xì)胞[7]等，因此，D-阿洛酮糖在降低糖吸收、調(diào)控身體機(jī)能以及抑制癌細(xì)胞等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，市場潛力廣闊。

D-阿洛酮糖是D-果糖在C3位置的差向異構(gòu)體，目前，主要采用化學(xué)合成和生物合成技術(shù)實(shí)現(xiàn)D-阿洛酮糖的生產(chǎn)。采用化學(xué)合成技術(shù)，鉬酸鹽在80～120 ℃能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖[8]；生物合成主要是通過D-塔格糖差向異構(gòu)家族酶催化生成D-阿洛酮糖，與化學(xué)方法相比較，生物催化合成更為環(huán)保，分離純化難度更小。通過基因工程技術(shù)，催化產(chǎn)D-阿洛酮糖的D-塔格糖差向異構(gòu)家族酶已在大腸桿菌[9]、枯草芽孢桿菌[10]和釀酒酵母[11]中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，基因來源主要為梭狀芽孢桿菌[12-13]，瘤胃球菌[9]，根癌土壤桿菌[14-15]，球形紅菌[16]，密螺旋體屬菌[17]等。在國內(nèi)，江南大學(xué)采用通過D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶基因克隆、工程菌構(gòu)建和發(fā)酵控制等技術(shù)，將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖[17-18]。目前，全球D-阿洛酮糖的主要生產(chǎn)商韓國希杰第一制糖株式會社、英國泰萊和日本松谷集團(tuán)都采用生物方法，將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖。因此，構(gòu)建可催化產(chǎn)D-阿洛酮糖的基因工程菌是實(shí)現(xiàn)D-阿洛酮糖產(chǎn)業(yè)化的重要途徑。

本研究根據(jù)NCBI公布的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶(DPEase)基因的全序列，設(shè)計引物，擴(kuò)增DPEase基因，通過生物信息學(xué)軟件分析基因序列，預(yù)測翻譯后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)；構(gòu)建原核重組質(zhì)粒，檢測DPEase基因在E.coliBL21中誘導(dǎo)表達(dá)，為進(jìn)一步構(gòu)建DPEase基因工程菌提供材料。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105由唐曉鳳博士饋贈，保存于合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品精深加工實(shí)驗(yàn)室；E.coliDH5α、E.coliBL 21感受態(tài)細(xì)胞、FastPfuDNA聚合酶、pEASY-Blunt E1表達(dá)載體、氨芐青霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)購自北京全式金生物公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒和SanPrep柱式DNA小量抽提試劑盒，生工(上海)公司；引物由生工(上海)公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Nano- 100型分光光度計，杭州奧盛儀器公司；TC- 96型PCR儀，杭州博日公司；Universal Hood Ⅱ型全自動凝膠成像儀和蛋白電泳儀，美國Bio- Rad公司；EPS300 DNA型電泳儀和電泳槽，上海天能公司；E2695型高效液相色譜系統(tǒng)，美國Waters公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1重組大腸桿菌的構(gòu)建

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公開的根癌農(nóng)桿菌編碼的DPEase基因 (KX098480.1)，設(shè)計引物，上游引物：5′- CAGAAAAGCGAAAGAGACACC -3′；下游引物：5′- TGAGGATATTATCGCAAATC -3′；以提取的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增DPEase基因，回收目的片段，將目的片段與pEASY-Blunt E1載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21，通過抗性培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，PCR鑒定擬轉(zhuǎn)化子。

1.3.2生物信息學(xué)分析

采用NCBIBLAST比對核苷酸及氨基酸序列，通過NCBI在線ORF finder尋找基因編碼框，利用Prot-Param在線軟件分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，采用Signal P 4.1 Server預(yù)測蛋白信號肽，利用TMHMM 2.0 Server分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)，采用Predict Protein在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，利用 Swiss-Model在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

1.3.3重組DPEase的誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化

重組E.coliBL21接種于200 mL含100 μg/mL氨芐的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)，過夜，然后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，在溫度16 ℃和搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下培養(yǎng)32 h，誘導(dǎo)重組菌表達(dá)外源蛋白。在4 ℃下，8 000 r/min離心10 min，收集菌體，生理鹽水洗滌3次，緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH=8)重懸；在冰浴條件下，超聲(功率300 W，工作3 s，間歇5 s，90次)破碎細(xì)胞，12 000 r/min離心15 min收集上清液，獲得粗酶液；用0.22 μm微孔濾膜過濾粗酶液，將粗酶液加到層析柱上，低濃度咪唑洗脫液洗脫雜蛋白質(zhì)，高濃度咪唑洗脫液洗脫目的蛋白質(zhì)，目的蛋白質(zhì)放入10 kDa的超濾管中濃縮除雜，SDS-PAGE檢測重組DPEase。

層析柱預(yù)處理是在4 ℃條件下，采用上樣緩沖液(50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，pH=7.4)平衡Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow親和層析柱。低濃度咪唑洗脫液為50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH=7.4。高濃度咪唑洗脫液為50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH=7.4。

1.3.4D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶活力測定

設(shè)置的5 mL催化反應(yīng)體系中含有1 mL酶液、500 g/L D-果糖和50 mmol/L Tris-HCl(pH=8)，在55 ℃和150 r/min條件下保溫10 min，采用高效液相色譜法測定D-阿洛酮糖的含量[19]，液相色譜柱為RezexTM RCM-monosaccharide Ca2+(Phenomenex IncTorrance, USA)，檢測器為2410型示差檢測器，流動相為超純水。設(shè)置參數(shù)：柱溫80 ℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。單位酶活力定義為1 min生成1 μmol D-阿洛酮糖為一個酶活力單位，以U/mL表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組大腸桿菌的構(gòu)建結(jié)果

以提取的根癌農(nóng)桿菌基因組DNA為模板，根據(jù)DPEase序列設(shè)計的引物進(jìn)行擴(kuò)增，電泳結(jié)果見圖1。

泳道M 為marker，1為陰性對照，2～4為擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1 根癌農(nóng)桿菌DPEase基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of A. tumefaciens DPEase gene

由圖1可知，電泳檢測出一條約900 bp的目的片段，與預(yù)期大小一致。

目的片段與表達(dá)載體pEASY-Blunt E1連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，通過抗性篩選，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，測序驗(yàn)證正確，轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主菌E.coliBL21中，通過抗性固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，采用DPEase引物PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子基因組，鑒定工程菌，見圖2。

泳道M為marker，1～4為擬轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增產(chǎn)物，5為陰性對照，6為陽性對照。圖2 PCR鑒定DPEase E. coli BL21轉(zhuǎn)化子Fig.2 PCR identification of DPEase transformants of E. coli BL21

由圖2可知，被檢測的轉(zhuǎn)化子都能擴(kuò)增出與目的基因預(yù)期一致的DNA條帶，初步說明構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒已轉(zhuǎn)化入E.coliBL21細(xì)胞內(nèi)。

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1序列分析

對測定的DPEase序列進(jìn)行開放閱讀框分析，結(jié)果表明，該序列包含1個完整的開放閱讀框，由870 bp核苷酸組成，編碼289個氨基酸。通過在線同源性分析，該基因與NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中根癌農(nóng)桿菌編碼D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶基因 NCIM：2942(KX098480.1)的核苷酸序列相似性為99.43%。

2.2.2DPEase蛋白的理化性質(zhì)分析

采用軟件Prot Param預(yù)測DPEase的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，DPEase蛋白由289個氨基酸組成，其中含量最高是甘氨酸G，占11.07%，其次是丙氨酸A，占10.73%，最低的是谷氨酰胺Q和半胱氨酸C；帶負(fù)電的殘基(Asp+Glu)37個，帶正電的殘基(Arg+Lys)31個；其理論分子質(zhì)量31 493.62，共由4 406個原子組成，分子式為C1 410H2 182N390O417S7，等電點(diǎn)PI為6；根據(jù)蛋白質(zhì)的平均疏水性值判斷蛋白質(zhì)的疏水性，該蛋白為親水性蛋白。

2.2.3信號肽和跨膜區(qū)的預(yù)測結(jié)果

通過Signal P 4.1 Server的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對DPEase蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果如圖3。

圖3 Signal P- 4.1預(yù)測DPEase蛋白信號肽得分Fig.3 Prediction scores of DPEase signal peptide by Signal P- 4.1

由圖3可知，Y得分最高分值(0.143)為第12位的組氨酸殘基，S得分為0.107，DPEase基因所編碼的蛋白無信號肽，為非分泌蛋白。

利用TMHMM 2.0 Server進(jìn)行DPEase蛋白的跨膜區(qū)分析，結(jié)果見圖4。

圖4 基于TMHMM的后驗(yàn)概率跨膜區(qū)分析結(jié)果Fig.4 Analysis of transmembrane region based on TMHMM posterior probability

由圖4可見，該蛋白質(zhì)在膜內(nèi)的概率僅為0.063 42，所編碼的289個氨基酸從1到289全部在膜外；跨膜螺旋數(shù)為0，圖中未出現(xiàn)矩形跨膜區(qū)。因此，該蛋白質(zhì)位于細(xì)胞膜外，無跨膜區(qū)。

2.2.4DPEase蛋白的二級結(jié)構(gòu)

Predict protein預(yù)測結(jié)果表明，DPEase蛋白含有13個α-螺旋和8個β-折疊，α-螺旋占38.41%，β-折疊47.06%，另外，14.53%的氨基酸處于無規(guī)則卷曲狀態(tài)；非跨膜蛋白、α-螺旋跨膜蛋白和β-桶狀跨膜蛋白的可能性依次為0.997 2、0.002 6和0.000 2，因此，DPEase屬于非跨膜蛋白，預(yù)測結(jié)果與TMHMM 2.0 Server軟件分析結(jié)果一致。

2.2.5DPEase蛋白的三級結(jié)構(gòu)

根據(jù)Swiss-Model在線軟件進(jìn)行建模預(yù)測，采用D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶2hk1.1.A為模型建立DPEase蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖5。

圖5 DPEase蛋白的四聚體和單體結(jié)構(gòu)Fig.5 Tetramer and monomer structure of DPEase

由圖5可知，DPEase的氨基酸序列與2hk1.1.A模板的序列一致性為99.65%，建模的可信度較高。該DPEase的氨基酸序列在191位與模型有差異，此位點(diǎn)不屬于活性結(jié)合位點(diǎn)；另外，I66、G67、G106、A107、W112、E150、L152、E156、D183、H186、H209、R215、E244和I257為D-果糖催化活性位點(diǎn)；E150、D183、H209和E244為Mn2+離子結(jié)合位點(diǎn)。

2.3 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

在16 ℃下，1 mmol /L IPTG 誘導(dǎo)重組菌E.coliBL21表達(dá)DPEase，結(jié)果見圖6。

圖6 IPTG 誘導(dǎo)E.coli BL21工程菌表達(dá)DPEase酶活力Fig.6 DPEase activities of E.coli BL21 engineered strain induced by IPTG

由圖6可知，隨著誘導(dǎo)時間增長，目的蛋白表達(dá)量增大，而當(dāng)誘導(dǎo)24 h后，酶活增加緩慢，目的蛋白表達(dá)量在28 h時達(dá)到最大值0.32 g/L，酶活性最高為3.8 U/mL。

2.4 重組DPEase的分離純化結(jié)果

通過Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow親和層析柱，利用重組pEASY-Blunt E1-DPEase質(zhì)粒帶有的組氨酸標(biāo)簽和不同濃度的咪唑洗脫液，分離出目的蛋白，SDS-PAGE結(jié)果見圖7。

圖7 SDS-PAGE分析純化的DPEaseFig.7 SDS-PAGE analysis of purified DPEase

由圖7可知，純化后的蛋白質(zhì)為單一條帶，分子質(zhì)量約為33 kDa，根癌農(nóng)桿菌DPEase基因能夠在E.coliBL21宿主中表達(dá)。

3 結(jié) 論

本文通過生物信息學(xué)分析根癌農(nóng)桿菌DPEase蛋白結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已報道的結(jié)論接近。在分子質(zhì)量預(yù)測上，本研究和Park等[20]研究表明，根癌農(nóng)桿菌DPEase分子質(zhì)量為33 kDa，與軟件Prot Param預(yù)測的理論分子質(zhì)量31 493.62相近；在DPEase晶體結(jié)構(gòu)上，已有研究表明，DPEase蛋白為四聚體結(jié)構(gòu)，每個單體呈典型TIM桶狀，由(β/α)8結(jié)構(gòu)組成，每個單體含有13個α-螺旋和8個β-折疊[14]，與本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測獲得的結(jié)果相一致；在三級結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)分析方面，Kim等[14]通過定點(diǎn)突變研究表明，位點(diǎn)I66、A107、W112、E156和R215影響根癌農(nóng)桿菌DPEase結(jié)合D-果糖的效率，H209影響Mn2+與底物結(jié)合[21]，本研究通過預(yù)測，獲得相似的結(jié)論。本研究通過分子克隆和原核表達(dá)檢測根癌農(nóng)桿菌DPEase的性質(zhì)，與已知報道接近[14，21]，研究表明，通過構(gòu)建原核表達(dá)載體能夠?qū)崿F(xiàn)DPEase的高效表達(dá)，但其酶學(xué)性質(zhì)以及在催化產(chǎn)D-阿洛酮糖等方面的應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。