第27 屆國(guó)際生物學(xué)奧林匹克競(jìng)賽試題實(shí)驗(yàn)3·生物化學(xué)與微生物學(xué)

范六民 戴俊彪 張 立 陶若婷 張雁云

（1 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100871 2 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100084 3 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100875 4 北京十一學(xué)校 北京 110000）

總分：100 分；時(shí)間：90 min。

本次考試包括下列3 個(gè)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)1：蛋白的表達(dá)、純化和鑒定（40 分）

實(shí)驗(yàn)2：咖啡提取物的抗氧化活性（30 分）

實(shí)驗(yàn)3：乳酸發(fā)酵（30 分）

請(qǐng)注意以下內(nèi)容：

·請(qǐng)把答案填寫(xiě)在答題卡上。

·請(qǐng)檢查所有的材料和設(shè)備， 確定你已經(jīng)收到所有列出的材料和設(shè)備。

·實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，請(qǐng)正確使用儀器設(shè)備。任何濺灑的試劑和損壞的儀器都無(wú)法再次獲得。

·實(shí)驗(yàn)1 中的凝膠電泳不得在最后30 min內(nèi)完成，建議你首先開(kāi)展實(shí)驗(yàn)1。

·在實(shí)驗(yàn)2 中， 請(qǐng)注意獲取分光光度計(jì)上的讀數(shù)，否則無(wú)法回答該問(wèn)題。

材料和設(shè)備

設(shè)備和用于3 個(gè)實(shí)驗(yàn)的材料：

名稱 數(shù)量P1000 微量移液器（100～1 000 滋L） 1件P200 微量移液器（20～200 滋L） 1件P20 微量移液器（2～200 滋L） 1件用于P1 000 微量移液器的槍頭 1盒用于P20 和P200 微量移液器的槍頭 1盒去離子水（dH2O） 1瓶微量試管（EP 管）架 1件用于液體廢物存放的圓形塑料容器（廢液） 1件用于固體廢物存放的方形塑料容器（固體廢物） 1件計(jì)時(shí)器 1件手套 1副衛(wèi)生紙 1盒膠1管學(xué)生條碼標(biāo)簽 5件紅牌 1件綠牌 1件計(jì)算器 1件記號(hào)筆 1件防護(hù)眼鏡 1件

用于實(shí)驗(yàn)1：

名稱 數(shù)量SDS-PAGE 凝膠電泳槽和電源 1套凝膠電泳梳子 1件凝膠容器（含學(xué)生代碼） 1件1.5 mL 離心管 10 件裝配有聚丙烯酰胺凝膠盒的凝膠電泳槽 1件包含2× SDS-PAGE 上樣緩沖液的品紅色離心管（緩沖液） 1件裝有8 滋L 蛋白質(zhì)marker 的黃色微離心管（M） 1件裝有30 滋L 細(xì)胞，不含有IPTG 的離心管（NO_IPTG） 1件裝有30 滋L 細(xì)胞，含有IPTG 的離心管（IPTG） 1件裝有IPTG 誘導(dǎo)后，30 滋L 細(xì)胞裂解液離心后所得沉淀的離心管（Pellet） 1件裝有IPTG 誘導(dǎo)后，30 滋L 細(xì)胞裂解液離心后所得上清的離心管（Super） 1件裝有30 滋L 純化后蛋白質(zhì)的微量離心管（Puri-P） 1件包含40 mL 的SDS-PAGE 染色溶液的Falcon 試管（綠帽）（STAIN） 1件

用于實(shí)驗(yàn)2：

名稱 數(shù)量帶有學(xué)生代碼的96 孔板（請(qǐng)勿觸碰板的底部） 1件包含300 滋L，1 mg/mL 抗壞血酸溶液的藍(lán)色離心管（AA） 1件包含300 滋L，5 mg/mL 咖啡提取物的藍(lán)色離心管（CC） 1件包含15 mL，0.2 mnol/L DPPH 溶液的棕色瓶（DPPH） 1件

用于實(shí)驗(yàn)3：

?

實(shí)驗(yàn)1 蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化和分析（40 分）

介紹：H 和B 蛋白質(zhì)是氣單胞菌（Aeromonas hydrophilas）的2 個(gè)重要蛋白。為了研究它們，科學(xué)家希望在大腸桿菌中共同表達(dá)它們。因此，B 基因和H 基因分別被克隆到表達(dá)載體P1 的多克隆位點(diǎn)1（MCS-1）和多克隆位點(diǎn)2（圖1.1）。 所得到的載體P1-b-h 被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，利用IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。然后通過(guò)親和層析，利用鎳柱純化帶有6xHis 標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。 最后通過(guò)SDS-PAGE，針對(duì)蛋白質(zhì)分子量的大小， 對(duì)純化后所獲得的蛋白進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。 注意：H 的分子量比B 小。

圖1.1 表達(dá)載體的P1 的總覽圖

帶有P1-b-h 殼的大腸桿菌單菌落在50 mL的LB 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6。 為了分析重組蛋白的表達(dá)和純化， 科學(xué)家已收集以下這幾個(gè)細(xì)胞和蛋白樣品：

·NO-IPTG：1 mL 培養(yǎng)液被轉(zhuǎn)移到一個(gè)培養(yǎng)管中，在20℃生長(zhǎng)16 h（OD600=2.4）后離心。 棄去上清液后將細(xì)胞沉淀重新懸浮于50 μL H20 中，加入50 μL 2× SDS-PAGE 上樣緩沖液混合，得到100 μL 樣品。

在剩余的49 mL 培養(yǎng)液中，添加IPTG。在20℃培養(yǎng)16 h，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

·IPTG：取1 mL IPTG 誘導(dǎo)后的菌液（OD600=1.4）離心。 棄去上清液，將細(xì)胞沉淀重新懸浮于50 μL H20 中，然后加入50 μL 2× SDS-PAGE 上樣緩沖液混合，得到100 μL 樣品。

將剩余48 mL 培養(yǎng)液離心，棄去上清液并將細(xì)胞沉淀重懸于2 mL 緩沖液中；將細(xì)胞懸浮液裂解，并隨后離心分離。 上清液和沉淀均需要收集。

·Pellet（沉淀）：將IPTG 誘導(dǎo)后細(xì)胞裂解液離心所得的沉淀物重新懸浮于2 mL 緩沖液中，然后加入2 mL 2× SDS-PAGE 上樣緩沖液 （沉淀儲(chǔ)存液）混合。

·Super（上清）：將10 μL，IPTG 誘導(dǎo)后的細(xì)胞裂解物中得到的上清液10 μL 2× SDS-PAGE上樣緩沖液混合。

·Puri-P（純化后的蛋白）：剩余上清液加入到用于蛋白質(zhì)純化的鎳柱。 純化后的蛋白質(zhì)用2 mL 洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。取10 μL 洗脫所得的蛋白質(zhì)與10 μL 2× SDS-PAGE 上樣緩沖液混合。

將所有用于SDS-PAGE 分析的樣品在100℃煮沸5 min。

設(shè)計(jì)SDS-PAGE 實(shí)驗(yàn)，分析蛋白的表達(dá)。

用于SDS-PAGE 分析的總蛋白標(biāo)準(zhǔn)終濃度必須相當(dāng)于5×l06個(gè)細(xì)胞／μL。 首先，計(jì)算每個(gè)樣品中的細(xì)胞濃度。 OD600值為1 相當(dāng)于知8×108個(gè)細(xì)胞／mL。 請(qǐng)考慮操作過(guò)程中各樣品的稀釋度。

問(wèn)題1.1 （6 分）

計(jì)算并在下表中填寫(xiě)樣品的體積（μL）。 用一位小數(shù)。

管1 管2 管3 管4 管5 管6樣品 蛋白marker NO-IPTG IPTG Pellet SuerPuri-P儲(chǔ)液（μL） 5 14.9 14.9 15 H2O（μL） 5 12.5 12.5 12.5 2× SDS-PAGE 緩沖液 10 12.6 12.6 12.5總體積（μL） 20 40 40 40 40 40

實(shí)驗(yàn)步驟

·根據(jù)上面的表格， 準(zhǔn)備在提供空離心管所有SDS-PAGE 樣品。 通過(guò)上下吹打4～5 次混勻各樣品。

完成此步驟后，請(qǐng)舉起綠卡。助手將引導(dǎo)你去上樣區(qū)，并幫助將你的學(xué)生代碼粘貼到電泳槽上。

·將每個(gè)樣品點(diǎn)樣20 μL 到SDS-PAGE 膠上，必須按管1～6 的順序上樣。 為上樣，請(qǐng)使用P20移液器和槍頭吸取20 μL 樣品， 并小心地將槍頭置于加樣孔的頂部（1.2）。

圖1.2 在SDS 凝膠樣品裝載

·實(shí)驗(yàn)助理將運(yùn)行SDS-PAGE 20 min。 他會(huì)告知你設(shè)置定時(shí)器20 min。

在SDS-PAGE 進(jìn)行過(guò)程中你可以做另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。 20 min 后， 請(qǐng)舉起綠卡， 通知助理將SDSPAGE 凝膠返還給你。

·如圖所示（圖1.3），將塑料盒中的SDS-PAGE凝膠用凝膠梳子打開(kāi)，將凝膠放到膠容器中。

圖1.3 從凝膠盒中取出SDS-PAGE 凝膠操作示意圖

步驟1）將梳子插入凝膠盒各個(gè)槽口，轉(zhuǎn)動(dòng)梳子把凝膠盒撬動(dòng)。從頂部的槽口開(kāi)始，沿著盒的每一側(cè)向下移動(dòng)。

步驟2）當(dāng)兩側(cè)打開(kāi)后，將梳子放置在斜邊底角板之間的45 度角，用力扭轉(zhuǎn)。

步驟3）輕輕將2 個(gè)盒分開(kāi)。

·在凝膠容器搖加入40 mL 的染色溶液（STAIN），放置在搖床上轉(zhuǎn)動(dòng)染色10 min。

·將凝膠容器中的染色溶液倒入廢液桶，使用去離子水清洗凝膠3 次。

完成上述操作后，舉起綠卡，請(qǐng)助理幫助拍取凝膠照片。

問(wèn)題1.2 SDS-PAGE 結(jié)果（10 分）

得到SDS-PAGE 凝膠照片后， 將其粘貼在答題卡指定的地方。

問(wèn)題1.3 （4 分）

基于圖1.4A 提供的資料，將至少5 個(gè)標(biāo)記蛋白，根據(jù)它們的分子量和相對(duì)遷移的Rf 值，在答題卡規(guī)定的圖形文件上取點(diǎn)作圖 （Rf=蛋白質(zhì)遷移距離／染料前端遷移距離）。

圖1.4 蛋白marker（A）和方格紙（B）

問(wèn)題1.4 （4 分）

利用問(wèn)題1.3 中的圖標(biāo)及SDS-PAGE 膠圖，分別估算蛋白H 和B 的分子量。

問(wèn)題1.5 （4 分）

基于SDS-PAGE 結(jié)果， 判斷下列陳述的對(duì)和錯(cuò)。 在答題卡上用“√”表明正誤。

A. H 蛋白在含有IPTG 的LB 培養(yǎng)基中是過(guò)表達(dá)的

B. B 蛋白在鎳柱結(jié)合緩沖液中是完全可溶的

C. H 和B 蛋白相互作用

D. 大部分的重組蛋白被結(jié)合到了鎳柱上

問(wèn)題1.6 （4 分）

根據(jù)P1 表達(dá)載體（圖1.5）的詳細(xì)酶切圖譜，判斷下列陳述的對(duì)錯(cuò)。 在答題卡上用“√”表明正誤。

以下陳述正確的打“√”，錯(cuò)誤的打“×”。

A. Sal I 和Bam HI 可以用于將b 基因插入到MCS-1

B.為了能同時(shí)進(jìn)行表達(dá)，基因h 和b 應(yīng)以相同的轉(zhuǎn)錄取向進(jìn)行克隆

C.為了能同時(shí)進(jìn)行表達(dá)，基因h 和B 要位于同一開(kāi)放閱讀框中

D.為了維持質(zhì)粒在細(xì)菌中的穩(wěn)定存在，必須在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉（ampicillin）

為了表征H 和B 蛋白的寡聚狀態(tài)，準(zhǔn)備如下3 個(gè)蛋白樣品：1）H 蛋白；2）從上述實(shí)驗(yàn)中得到的H 和B 蛋白；3）B 蛋白。 樣 品1 和樣品2 是透明的，但樣品3 中大部分蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。 將樣品1和樣品2 分別通過(guò)凝膠過(guò)濾柱。 所獲得的蛋白分離譜如圖1.6A 所示。不同大小參照分子在凝膠過(guò)濾柱上的分離如圖1.6B 所示。

圖1.5 P1 表達(dá)載體詳細(xì)的限制性圖譜

圖1.6 H 和B 蛋白的凝膠過(guò)濾分析

問(wèn)題1.7 （4 分）

計(jì)算樣品1 和樣品2 中， 蛋白所對(duì)應(yīng)凝膠過(guò)濾峰的相對(duì)大小，填寫(xiě)在下表中。

樣品 分子量（kDa）樣品1 中觀察到的峰樣品2 中觀察到的峰

問(wèn)題1.8 （4 分）

判斷下列陳述的正確與錯(cuò)誤。 在答題卡上用“√”表明正或誤。

A. H 蛋白以單體的形式存在

B. H 和B 可能以異源二聚體形式存在

C. H 蛋白有助于B 蛋白的穩(wěn)定存在

D. 在非變性凝膠過(guò)濾柱分析中，一個(gè)蛋白質(zhì)的保留時(shí)間和它們的分子量大小成正比

實(shí)驗(yàn)2 咖啡提取物的抗氧化活性（30 分）

介紹：生物氧化產(chǎn)生活性氧自由基，可造成細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p壞?？寡趸瘎┦悄芮宄杂苫?，從而抑制氧化反應(yīng)的分子。 抗氧化劑包括還原劑如硫醇化合物，抗壞血酸及酚醛等?？Х韧ㄟ^(guò)烘焙咖啡豆制備，是抗氧化劑的一個(gè)潛在來(lái)源。

在2，2-diphenyl-l-picrylhydrazyl（DPPH）清除實(shí)驗(yàn)中，DPPH 的量被不斷減小， 從而失去其紫色。SC50值（清除能力）通常用于抗氧化活性的評(píng)估。 此值表示清除50%的DPPH 自由基所需樣品的濃度。

DPPH 吸收率可以在517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定。 假設(shè)空白的吸光度可忽略不計(jì)。 對(duì)照組（無(wú)清除劑，Ac）和樣品（As）的吸光度將用于計(jì)算不同濃度樣本的清除率（SC%）：

SC（%）=（Ac-As）×l00／Ac

根據(jù)一系列樣品中不同濃度和相應(yīng)的清除百分比的對(duì)數(shù)，可以做圖并從中計(jì)算獲得SC50值。

本實(shí)驗(yàn)將研究一個(gè)越南咖啡品種（Coffea canephora）的抗氧化活性。 咖啡豆粉混合物（1 g）在80℃下，懸浮于去離子水中30 min，然后過(guò)濾。 加入去離子水，將萃取液的總體積定量為200 mL。

實(shí)驗(yàn)步驟和問(wèn)題：

圖2.1 96 孔微量培養(yǎng)板

上面的96 孔微量培養(yǎng)板可用于開(kāi)展系列稀釋實(shí)驗(yàn)。 微孔板上孔的位置由一個(gè)代表行的字母（A～H）和一個(gè)代表列的數(shù)字（1～12）表示。

·使用微量移液器制備4 個(gè)抗壞血酸溶液（AA1-AA4， 分別位于A1-A4 孔中） 和4 個(gè)咖啡萃取液溶液（CC1-CC4，分別位于A6-A9 孔中）。每個(gè)溶液都是2 倍稀釋。 抗壞血酸和咖啡提取液最低濃度分別是0.025 mg/mL 和0.625 mg/mL。每個(gè)孔中的溶液在稀釋前都是200 mL。

注意：如果在加樣過(guò)程中不慎發(fā)生錯(cuò)誤，可以將抗壞血酸溶液和咖啡萃取液溶液分別放置到孔H1-H4（AA1-AA4）和H6-H9（CC1-CC4）。

問(wèn)題2.1 （4 分）

將你準(zhǔn)備抗壞血酸和咖啡提取物的稀釋計(jì)算填入下表中。

稀釋液 AA1 AA2 AA3 AA4 CC1 CC2 CC3 CC4用于稀釋溶液的體積（滋L）H2O（滋L）的體積濃度（mg／mL） 0.025 0.625

·從行A 各個(gè)孔內(nèi)的抗壞血酸溶液和咖啡提取物溶液中分別移取20 滋L， 放置到行B、C 和D的相應(yīng)孔內(nèi)。如果在此步驟中不慎發(fā)生錯(cuò)誤，可在行E、F 和G 中重復(fù)上述操作。

·在孔B11、C11 和D11 中各加入20 滋L 水。

·在步驟2 和3 中準(zhǔn)備的孔內(nèi)，各加入180 滋L的DPPH 溶液。

·將蓋子蓋好96 孔板，在室溫下孵育10 min。請(qǐng)?jiān)O(shè)置定時(shí)器計(jì)時(shí)。

完成此步驟后，請(qǐng)舉起綠卡。請(qǐng)助理幫助你用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，并返回你打印好的輸出數(shù)據(jù)。

問(wèn)題2.2 （5 分）

計(jì)算抗壞血酸和咖啡萃取物濃度的對(duì)數(shù)值（log10），并填入答題卡上的表格內(nèi)（所有數(shù)字四舍五入至2 位小數(shù)）。 你可根據(jù)下列步驟，使用計(jì)算器計(jì)算對(duì)數(shù)值：

·按ON 鍵，打開(kāi)計(jì)算器。

·按4 個(gè)鍵：“SHIFT”鍵、“CLR”鍵、“2”鍵、“=”鍵返回到計(jì)算模式。

·按“l(fā)og”鍵。

·輸入數(shù)字。

·按“=”鍵。

計(jì)算每個(gè)稀釋的平均吸光度、 每個(gè)樣品的清除率并填入下表。

溶液 對(duì)照AA1 AA2 AA3 AA4 CC1 CC2 CC3 CC4 Log10 濃度（mg／mL）平均吸光度SC%

問(wèn)題2.3 （5 分）

Log10 濃度（mg／mL）

使用計(jì)算值， 在答題卡上給出的網(wǎng)格線中繪制清除率對(duì)應(yīng)抗壞血酸濃度的對(duì)數(shù)（log10）的線性曲線。

問(wèn)題2.4 （5 分）

計(jì)算抗壞血酸和咖啡提取物的SC50值，并填入答題卡上表格中（你可以利用問(wèn)題2.3 中的格子對(duì)咖啡萃取液作一條線性曲線，但該曲線并不算分）。

抗壞血酸 咖啡萃取物SC50

問(wèn)題2.5 （3 分）

使用相同的方法， 某2 個(gè)咖啡品種提取物的SC50的值如下：

咖啡提取物 SC50 X 3.8 mg／mL Y 2.6 mg／mL

比較包括本實(shí)驗(yàn)中咖啡豆（Z）的抗氧化活性，依據(jù)從強(qiáng)到弱的順序， 把不同類型的咖啡豆填入下表的空格處。

＞＞

問(wèn)題2.6 （4 分）

假設(shè)你在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同稀釋度的咖啡提取物和DPPH 混合物的吸光度非常接近， 差異可忽略不計(jì)。 請(qǐng)判斷下列陳述是正確還是錯(cuò)誤，用“√”表明。

A.稀釋后的咖啡提取物的抗氧化活性可以忽略不計(jì)

B.為了更準(zhǔn)確地測(cè)定抗氧化活性，需要利用更高濃度的樣品進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)

C.咖啡提取物中存在的抗氧化酶的活性導(dǎo)致了上述結(jié)果

D.如果孔中存在NADH 污染，其結(jié)果將類似于上述假設(shè)

問(wèn)題2.7 （4 分）

一個(gè)學(xué)生使用和你一樣的方法（方法A）測(cè)定了一個(gè)樣品的抗氧化活性。與此同時(shí)，他又使用了另一不同方法（方法A*）進(jìn)行測(cè)量。他所得的結(jié)果如下：

方法A 方法A*SC50（mg／mL） 1.95 3.9

下列哪些變化可能導(dǎo)致更高的SC50值？ 請(qǐng)判斷下列陳述是正確還是錯(cuò)誤，用“√”表明。

A.該學(xué)生在方法A*中可能使用了0.1 mm 的DPPH

B.該學(xué)生在方法A*中可能使用了10 μL 的樣品

C.加入DPPH 后，該學(xué)生將96 孔板孵育的時(shí)間可能比方法A 中的短

D.該學(xué)生可能使用了對(duì)抗氧劑更好的溶劑

實(shí)驗(yàn)3 乳酸發(fā)酵（30 分）

介紹：近日，科學(xué)家分離出越南傳統(tǒng)發(fā)酵芥菜同型酸乳酸桿菌菌株（Lactobacillus sp. VN156）。在該實(shí)驗(yàn)中， 乳酸桿菌VN156 在MRS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。 培養(yǎng)基的初始pH 為5.6。 在培養(yǎng)過(guò)程中的不同時(shí)間點(diǎn)取樣， 測(cè)定細(xì)菌在600 nm 的光密度（OD）（圖3.1）。 樣品A0、A2、A3 和A5 是所收集菌液的上清液，將用于分析乳酸的濃度。

圖3.1 乳酸桿菌VN156 的生長(zhǎng)曲線

問(wèn)題3.1 （3 分）

假設(shè)圖3.1 表示生長(zhǎng)的真實(shí)過(guò)程。 計(jì)算乳酸桿菌VN156 在指數(shù)生長(zhǎng)期的增代時(shí)間（h），將數(shù)值填入答題卡中。

問(wèn)題3.2 （3 分）

如果將1 mL，培養(yǎng)9 h 后的菌液稀釋到新鮮的MRS 培養(yǎng)基中，計(jì)算培養(yǎng)6 h 后的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量，記錄在答題卡中。

pH 計(jì)的校準(zhǔn)。

使用便攜式pH 計(jì)（圖3.2）測(cè)量pH 值。

圖3.2 便攜式pH 計(jì)

步驟1）按照?qǐng)D3.3 中以下步驟校準(zhǔn)pH 計(jì)。

·撥動(dòng)ON／OFF 按鈕，打開(kāi)pH 計(jì)。

·取下保護(hù)蓋，用清水沖洗電極尖，輕輕地用紙巾擦干。

·將電極頭部浸入pH 值7.01 的緩沖溶液中。 確保電極末端完全浸沒(méi)在溶液中（約2 cm 的末端在溶液中）。 等待讀數(shù)穩(wěn)定。

·用螺絲刀， 輕輕旋轉(zhuǎn)pH7 微調(diào)螺絲， 直到屏幕上顯示pH 值為7.01。

·用水沖洗pH 電極，輕輕地用紙巾擦干。

·將電極頭部浸入pH4.01 的緩沖溶液中。等待讀數(shù)穩(wěn)定。

·用螺絲刀，輕輕旋轉(zhuǎn)pH4／10 微調(diào)螺絲，直到屏幕上顯示pH 值為4.01。

·校準(zhǔn)完成。

·注意：如果你關(guān)閉pH 計(jì)，再次打開(kāi)使用前應(yīng)重新校準(zhǔn)。

圖3.3 校準(zhǔn)pH 計(jì)

乳酸滴定：滴定是一種分析技術(shù)，可對(duì)溶解在溶液中的特定物質(zhì)（分析物）進(jìn)行定量測(cè)定。 它基于添加到溶液中、濃度已知的分析物和試劑（滴定劑）之間完全化學(xué)反應(yīng)。 在這一部分實(shí)驗(yàn)中，將通過(guò)滴定方法，用0.1 mol/L 的氫氧化鈉確定樣品中的乳酸濃度，如圖3.4 所示。

圖3.4 滴定裝置

問(wèn)題3.3 （2 分）

根據(jù)問(wèn)題3.2 的結(jié)果計(jì)算所需樣品（mL）和水（mL）的體積，并填入下表中。

培養(yǎng)時(shí)間（h）樣品稀釋因子樣品體積（mL）去離子水的體積（mL）總體積（mL）0 A0 2 30 6 A2 5 30 9 A3 10 30 15 A5 20 30

·根據(jù)你的計(jì)算，在100 mL 的燒杯中對(duì)每個(gè)樣品配制稀釋液。每個(gè)樣品準(zhǔn)備2 個(gè)重復(fù)樣品。請(qǐng)使用25 mL 的量筒移取去離子水，使用微量移液器和10 mL 的量筒中移取樣品。

·將一個(gè)磁性攪拌棒小心地放入稀釋的樣品溶液中。 夾緊pH 計(jì)，讓電極末端處于溶液中（約2 cm 的末端浸沒(méi)在溶液中）， 同時(shí)保證在攪拌的過(guò)程中攪拌子不會(huì)碰到pH 電極。 開(kāi)始進(jìn)行緩慢攪拌并記錄0.1 mol/L NaOH 溶液的起始體積。

·小心擰動(dòng)滴定管的活塞，讓NaOH 溶液從管中緩慢滴入燒杯里的樣品中。 當(dāng)pH 樣品變?yōu)橹行裕?.95～7.05）時(shí)，停止加入NaOH。 記錄0.1 mol/L NaOH 溶液的剩余終體積。

·每次滴定完成后， 小心地從溶液中取出pH電極，用清水沖洗。用鉗子取出攪拌子并用水沖洗。

·針對(duì)每個(gè)樣本，重復(fù)步驟2～5。

問(wèn)題3.4 （9 分）

記錄用于每個(gè)樣品滴定的0.1 mol/L 氫氧化鈉的體積，記錄在下表中。

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問(wèn)題3.5 （10 分）

計(jì)算滴定每個(gè)樣品，30 mL 儲(chǔ)備所需0.1 mol／L NaOH 的平均體積。 計(jì)算每個(gè)樣品中乳酸菌濃度。在下表中記錄所有數(shù)據(jù)。

培養(yǎng)時(shí)間（h） 樣品 滴定30 mL 儲(chǔ)備樣品用0.1 mol／L NaOH 的體積（mL）乳酸產(chǎn)量（g／L）0 A0 6 A2 9 A3 15 A5

問(wèn)題3.6 （3 分）

基于圖3.1，假設(shè)OD600=1 對(duì)應(yīng)于細(xì)胞濃度2×108個(gè)細(xì)胞/mL。 細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量增加2×108個(gè)細(xì)胞／mL， 乳酸的濃度將增加1g/L。 如果培養(yǎng)11 h后的乳酸濃度為6 g/L，計(jì)算細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量（細(xì)胞／mL），并記錄在答題卡中。