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    第27 屆國(guó)際生物學(xué)奧林匹克競(jìng)賽試題實(shí)驗(yàn)3·生物化學(xué)與微生物學(xué)

    2019-06-15 01:33:40范六民戴俊彪陶若婷張雁云
    生物學(xué)通報(bào) 2019年2期
    關(guān)鍵詞:答題卡離心管緩沖液

    范六民 戴俊彪 張 立 陶若婷 張雁云

    (1 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100871 2 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100084 3 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100875 4 北京十一學(xué)校 北京 110000)

    總分:100 分;時(shí)間:90 min。

    本次考試包括下列3 個(gè)實(shí)驗(yàn)

    實(shí)驗(yàn)1:蛋白的表達(dá)、純化和鑒定(40 分)

    實(shí)驗(yàn)2:咖啡提取物的抗氧化活性(30 分)

    實(shí)驗(yàn)3:乳酸發(fā)酵(30 分)

    請(qǐng)注意以下內(nèi)容:

    ·請(qǐng)把答案填寫(xiě)在答題卡上。

    ·請(qǐng)檢查所有的材料和設(shè)備, 確定你已經(jīng)收到所有列出的材料和設(shè)備。

    ·實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,請(qǐng)正確使用儀器設(shè)備。任何濺灑的試劑和損壞的儀器都無(wú)法再次獲得。

    ·實(shí)驗(yàn)1 中的凝膠電泳不得在最后30 min內(nèi)完成,建議你首先開(kāi)展實(shí)驗(yàn)1。

    ·在實(shí)驗(yàn)2 中, 請(qǐng)注意獲取分光光度計(jì)上的讀數(shù),否則無(wú)法回答該問(wèn)題。

    材料和設(shè)備

    設(shè)備和用于3 個(gè)實(shí)驗(yàn)的材料:

    名稱 數(shù)量P1000 微量移液器(100~1 000 滋L) 1件P200 微量移液器(20~200 滋L) 1件P20 微量移液器(2~200 滋L) 1件用于P1 000 微量移液器的槍頭 1盒用于P20 和P200 微量移液器的槍頭 1盒去離子水(dH2O) 1瓶微量試管(EP 管)架 1件用于液體廢物存放的圓形塑料容器(廢液) 1件用于固體廢物存放的方形塑料容器(固體廢物) 1件計(jì)時(shí)器 1件手套 1副衛(wèi)生紙 1盒膠1管學(xué)生條碼標(biāo)簽 5件紅牌 1件綠牌 1件計(jì)算器 1件記號(hào)筆 1件防護(hù)眼鏡 1件

    用于實(shí)驗(yàn)1:

    名稱 數(shù)量SDS-PAGE 凝膠電泳槽和電源 1套凝膠電泳梳子 1件凝膠容器(含學(xué)生代碼) 1件1.5 mL 離心管 10 件裝配有聚丙烯酰胺凝膠盒的凝膠電泳槽 1件包含2× SDS-PAGE 上樣緩沖液的品紅色離心管(緩沖液) 1件裝有8 滋L 蛋白質(zhì)marker 的黃色微離心管(M) 1件裝有30 滋L 細(xì)胞,不含有IPTG 的離心管(NO_IPTG) 1件裝有30 滋L 細(xì)胞,含有IPTG 的離心管(IPTG) 1件裝有IPTG 誘導(dǎo)后,30 滋L 細(xì)胞裂解液離心后所得沉淀的離心管(Pellet) 1件裝有IPTG 誘導(dǎo)后,30 滋L 細(xì)胞裂解液離心后所得上清的離心管(Super) 1件裝有30 滋L 純化后蛋白質(zhì)的微量離心管(Puri-P) 1件包含40 mL 的SDS-PAGE 染色溶液的Falcon 試管(綠帽)(STAIN) 1件

    用于實(shí)驗(yàn)2:

    名稱 數(shù)量帶有學(xué)生代碼的96 孔板(請(qǐng)勿觸碰板的底部) 1件包含300 滋L,1 mg/mL 抗壞血酸溶液的藍(lán)色離心管(AA) 1件包含300 滋L,5 mg/mL 咖啡提取物的藍(lán)色離心管(CC) 1件包含15 mL,0.2 mnol/L DPPH 溶液的棕色瓶(DPPH) 1件

    用于實(shí)驗(yàn)3:

    ?

    實(shí)驗(yàn)1 蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化和分析(40 分)

    介紹:H 和B 蛋白質(zhì)是氣單胞菌(Aeromonas hydrophilas)的2 個(gè)重要蛋白。為了研究它們,科學(xué)家希望在大腸桿菌中共同表達(dá)它們。因此,B 基因和H 基因分別被克隆到表達(dá)載體P1 的多克隆位點(diǎn)1(MCS-1)和多克隆位點(diǎn)2(圖1.1)。 所得到的載體P1-b-h 被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中,利用IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。然后通過(guò)親和層析,利用鎳柱純化帶有6xHis 標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。 最后通過(guò)SDS-PAGE,針對(duì)蛋白質(zhì)分子量的大小, 對(duì)純化后所獲得的蛋白進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。 注意:H 的分子量比B 小。

    圖1.1 表達(dá)載體的P1 的總覽圖

    帶有P1-b-h 殼的大腸桿菌單菌落在50 mL的LB 培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至OD600為0.6。 為了分析重組蛋白的表達(dá)和純化, 科學(xué)家已收集以下這幾個(gè)細(xì)胞和蛋白樣品:

    ·NO-IPTG:1 mL 培養(yǎng)液被轉(zhuǎn)移到一個(gè)培養(yǎng)管中,在20℃生長(zhǎng)16 h(OD600=2.4)后離心。 棄去上清液后將細(xì)胞沉淀重新懸浮于50 μL H20 中,加入50 μL 2× SDS-PAGE 上樣緩沖液混合,得到100 μL 樣品。

    在剩余的49 mL 培養(yǎng)液中,添加IPTG。在20℃培養(yǎng)16 h,誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

    ·IPTG:取1 mL IPTG 誘導(dǎo)后的菌液(OD600=1.4)離心。 棄去上清液,將細(xì)胞沉淀重新懸浮于50 μL H20 中,然后加入50 μL 2× SDS-PAGE 上樣緩沖液混合,得到100 μL 樣品。

    將剩余48 mL 培養(yǎng)液離心,棄去上清液并將細(xì)胞沉淀重懸于2 mL 緩沖液中;將細(xì)胞懸浮液裂解,并隨后離心分離。 上清液和沉淀均需要收集。

    ·Pellet(沉淀):將IPTG 誘導(dǎo)后細(xì)胞裂解液離心所得的沉淀物重新懸浮于2 mL 緩沖液中,然后加入2 mL 2× SDS-PAGE 上樣緩沖液 (沉淀儲(chǔ)存液)混合。

    ·Super(上清):將10 μL,IPTG 誘導(dǎo)后的細(xì)胞裂解物中得到的上清液10 μL 2× SDS-PAGE上樣緩沖液混合。

    ·Puri-P(純化后的蛋白):剩余上清液加入到用于蛋白質(zhì)純化的鎳柱。 純化后的蛋白質(zhì)用2 mL 洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。取10 μL 洗脫所得的蛋白質(zhì)與10 μL 2× SDS-PAGE 上樣緩沖液混合。

    將所有用于SDS-PAGE 分析的樣品在100℃煮沸5 min。

    設(shè)計(jì)SDS-PAGE 實(shí)驗(yàn),分析蛋白的表達(dá)。

    用于SDS-PAGE 分析的總蛋白標(biāo)準(zhǔn)終濃度必須相當(dāng)于5×l06個(gè)細(xì)胞/μL。 首先,計(jì)算每個(gè)樣品中的細(xì)胞濃度。 OD600值為1 相當(dāng)于知8×108個(gè)細(xì)胞/mL。 請(qǐng)考慮操作過(guò)程中各樣品的稀釋度。

    問(wèn)題1.1 (6 分)

    計(jì)算并在下表中填寫(xiě)樣品的體積(μL)。 用一位小數(shù)。

    管1 管2 管3 管4 管5 管6樣品 蛋白marker NO-IPTG IPTG Pellet SuerPuri-P儲(chǔ)液(μL) 5 14.9 14.9 15 H2O(μL) 5 12.5 12.5 12.5 2× SDS-PAGE 緩沖液 10 12.6 12.6 12.5總體積(μL) 20 40 40 40 40 40

    實(shí)驗(yàn)步驟

    ·根據(jù)上面的表格, 準(zhǔn)備在提供空離心管所有SDS-PAGE 樣品。 通過(guò)上下吹打4~5 次混勻各樣品。

    完成此步驟后,請(qǐng)舉起綠卡。助手將引導(dǎo)你去上樣區(qū),并幫助將你的學(xué)生代碼粘貼到電泳槽上。

    ·將每個(gè)樣品點(diǎn)樣20 μL 到SDS-PAGE 膠上,必須按管1~6 的順序上樣。 為上樣,請(qǐng)使用P20移液器和槍頭吸取20 μL 樣品, 并小心地將槍頭置于加樣孔的頂部(1.2)。

    圖1.2 在SDS 凝膠樣品裝載

    ·實(shí)驗(yàn)助理將運(yùn)行SDS-PAGE 20 min。 他會(huì)告知你設(shè)置定時(shí)器20 min。

    在SDS-PAGE 進(jìn)行過(guò)程中你可以做另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。 20 min 后, 請(qǐng)舉起綠卡, 通知助理將SDSPAGE 凝膠返還給你。

    ·如圖所示(圖1.3),將塑料盒中的SDS-PAGE凝膠用凝膠梳子打開(kāi),將凝膠放到膠容器中。

    圖1.3 從凝膠盒中取出SDS-PAGE 凝膠操作示意圖

    步驟1)將梳子插入凝膠盒各個(gè)槽口,轉(zhuǎn)動(dòng)梳子把凝膠盒撬動(dòng)。從頂部的槽口開(kāi)始,沿著盒的每一側(cè)向下移動(dòng)。

    步驟2)當(dāng)兩側(cè)打開(kāi)后,將梳子放置在斜邊底角板之間的45 度角,用力扭轉(zhuǎn)。

    步驟3)輕輕將2 個(gè)盒分開(kāi)。

    ·在凝膠容器搖加入40 mL 的染色溶液(STAIN),放置在搖床上轉(zhuǎn)動(dòng)染色10 min。

    ·將凝膠容器中的染色溶液倒入廢液桶,使用去離子水清洗凝膠3 次。

    完成上述操作后,舉起綠卡,請(qǐng)助理幫助拍取凝膠照片。

    問(wèn)題1.2 SDS-PAGE 結(jié)果(10 分)

    得到SDS-PAGE 凝膠照片后, 將其粘貼在答題卡指定的地方。

    問(wèn)題1.3 (4 分)

    基于圖1.4A 提供的資料,將至少5 個(gè)標(biāo)記蛋白,根據(jù)它們的分子量和相對(duì)遷移的Rf 值,在答題卡規(guī)定的圖形文件上取點(diǎn)作圖 (Rf=蛋白質(zhì)遷移距離/染料前端遷移距離)。

    圖1.4 蛋白marker(A)和方格紙(B)

    問(wèn)題1.4 (4 分)

    利用問(wèn)題1.3 中的圖標(biāo)及SDS-PAGE 膠圖,分別估算蛋白H 和B 的分子量。

    問(wèn)題1.5 (4 分)

    基于SDS-PAGE 結(jié)果, 判斷下列陳述的對(duì)和錯(cuò)。 在答題卡上用“√”表明正誤。

    A. H 蛋白在含有IPTG 的LB 培養(yǎng)基中是過(guò)表達(dá)的

    B. B 蛋白在鎳柱結(jié)合緩沖液中是完全可溶的

    C. H 和B 蛋白相互作用

    D. 大部分的重組蛋白被結(jié)合到了鎳柱上

    問(wèn)題1.6 (4 分)

    根據(jù)P1 表達(dá)載體(圖1.5)的詳細(xì)酶切圖譜,判斷下列陳述的對(duì)錯(cuò)。 在答題卡上用“√”表明正誤。

    以下陳述正確的打“√”,錯(cuò)誤的打“×”。

    A. Sal I 和Bam HI 可以用于將b 基因插入到MCS-1

    B.為了能同時(shí)進(jìn)行表達(dá),基因h 和b 應(yīng)以相同的轉(zhuǎn)錄取向進(jìn)行克隆

    C.為了能同時(shí)進(jìn)行表達(dá),基因h 和B 要位于同一開(kāi)放閱讀框中

    D.為了維持質(zhì)粒在細(xì)菌中的穩(wěn)定存在,必須在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉(ampicillin)

    為了表征H 和B 蛋白的寡聚狀態(tài),準(zhǔn)備如下3 個(gè)蛋白樣品:1)H 蛋白;2)從上述實(shí)驗(yàn)中得到的H 和B 蛋白;3)B 蛋白。 樣 品1 和樣品2 是透明的,但樣品3 中大部分蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。 將樣品1和樣品2 分別通過(guò)凝膠過(guò)濾柱。 所獲得的蛋白分離譜如圖1.6A 所示。不同大小參照分子在凝膠過(guò)濾柱上的分離如圖1.6B 所示。

    圖1.5 P1 表達(dá)載體詳細(xì)的限制性圖譜

    圖1.6 H 和B 蛋白的凝膠過(guò)濾分析

    問(wèn)題1.7 (4 分)

    計(jì)算樣品1 和樣品2 中, 蛋白所對(duì)應(yīng)凝膠過(guò)濾峰的相對(duì)大小,填寫(xiě)在下表中。

    樣品 分子量(kDa)樣品1 中觀察到的峰樣品2 中觀察到的峰

    問(wèn)題1.8 (4 分)

    判斷下列陳述的正確與錯(cuò)誤。 在答題卡上用“√”表明正或誤。

    A. H 蛋白以單體的形式存在

    B. H 和B 可能以異源二聚體形式存在

    C. H 蛋白有助于B 蛋白的穩(wěn)定存在

    D. 在非變性凝膠過(guò)濾柱分析中,一個(gè)蛋白質(zhì)的保留時(shí)間和它們的分子量大小成正比

    實(shí)驗(yàn)2 咖啡提取物的抗氧化活性(30 分)

    介紹:生物氧化產(chǎn)生活性氧自由基,可造成細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p壞??寡趸瘎┦悄芮宄杂苫?,從而抑制氧化反應(yīng)的分子。 抗氧化劑包括還原劑如硫醇化合物,抗壞血酸及酚醛等??Х韧ㄟ^(guò)烘焙咖啡豆制備,是抗氧化劑的一個(gè)潛在來(lái)源。

    在2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl(DPPH)清除實(shí)驗(yàn)中,DPPH 的量被不斷減小, 從而失去其紫色。SC50值(清除能力)通常用于抗氧化活性的評(píng)估。 此值表示清除50%的DPPH 自由基所需樣品的濃度。

    DPPH 吸收率可以在517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定。 假設(shè)空白的吸光度可忽略不計(jì)。 對(duì)照組(無(wú)清除劑,Ac)和樣品(As)的吸光度將用于計(jì)算不同濃度樣本的清除率(SC%):

    SC(%)=(Ac-As)×l00/Ac

    根據(jù)一系列樣品中不同濃度和相應(yīng)的清除百分比的對(duì)數(shù),可以做圖并從中計(jì)算獲得SC50值。

    本實(shí)驗(yàn)將研究一個(gè)越南咖啡品種(Coffea canephora)的抗氧化活性。 咖啡豆粉混合物(1 g)在80℃下,懸浮于去離子水中30 min,然后過(guò)濾。 加入去離子水,將萃取液的總體積定量為200 mL。

    實(shí)驗(yàn)步驟和問(wèn)題:

    圖2.1 96 孔微量培養(yǎng)板

    上面的96 孔微量培養(yǎng)板可用于開(kāi)展系列稀釋實(shí)驗(yàn)。 微孔板上孔的位置由一個(gè)代表行的字母(A~H)和一個(gè)代表列的數(shù)字(1~12)表示。

    ·使用微量移液器制備4 個(gè)抗壞血酸溶液(AA1-AA4, 分別位于A1-A4 孔中) 和4 個(gè)咖啡萃取液溶液(CC1-CC4,分別位于A6-A9 孔中)。每個(gè)溶液都是2 倍稀釋。 抗壞血酸和咖啡提取液最低濃度分別是0.025 mg/mL 和0.625 mg/mL。每個(gè)孔中的溶液在稀釋前都是200 mL。

    注意:如果在加樣過(guò)程中不慎發(fā)生錯(cuò)誤,可以將抗壞血酸溶液和咖啡萃取液溶液分別放置到孔H1-H4(AA1-AA4)和H6-H9(CC1-CC4)。

    問(wèn)題2.1 (4 分)

    將你準(zhǔn)備抗壞血酸和咖啡提取物的稀釋計(jì)算填入下表中。

    稀釋液 AA1 AA2 AA3 AA4 CC1 CC2 CC3 CC4用于稀釋溶液的體積(滋L)H2O(滋L)的體積濃度(mg/mL) 0.025 0.625

    ·從行A 各個(gè)孔內(nèi)的抗壞血酸溶液和咖啡提取物溶液中分別移取20 滋L, 放置到行B、C 和D的相應(yīng)孔內(nèi)。如果在此步驟中不慎發(fā)生錯(cuò)誤,可在行E、F 和G 中重復(fù)上述操作。

    ·在孔B11、C11 和D11 中各加入20 滋L 水。

    ·在步驟2 和3 中準(zhǔn)備的孔內(nèi),各加入180 滋L的DPPH 溶液。

    ·將蓋子蓋好96 孔板,在室溫下孵育10 min。請(qǐng)?jiān)O(shè)置定時(shí)器計(jì)時(shí)。

    完成此步驟后,請(qǐng)舉起綠卡。請(qǐng)助理幫助你用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度,并返回你打印好的輸出數(shù)據(jù)。

    問(wèn)題2.2 (5 分)

    計(jì)算抗壞血酸和咖啡萃取物濃度的對(duì)數(shù)值(log10),并填入答題卡上的表格內(nèi)(所有數(shù)字四舍五入至2 位小數(shù))。 你可根據(jù)下列步驟,使用計(jì)算器計(jì)算對(duì)數(shù)值:

    ·按ON 鍵,打開(kāi)計(jì)算器。

    ·按4 個(gè)鍵:“SHIFT”鍵、“CLR”鍵、“2”鍵、“=”鍵返回到計(jì)算模式。

    ·按“l(fā)og”鍵。

    ·輸入數(shù)字。

    ·按“=”鍵。

    計(jì)算每個(gè)稀釋的平均吸光度、 每個(gè)樣品的清除率并填入下表。

    溶液 對(duì)照AA1 AA2 AA3 AA4 CC1 CC2 CC3 CC4 Log10 濃度(mg/mL)平均吸光度SC%

    問(wèn)題2.3 (5 分)

    Log10 濃度(mg/mL)

    使用計(jì)算值, 在答題卡上給出的網(wǎng)格線中繪制清除率對(duì)應(yīng)抗壞血酸濃度的對(duì)數(shù)(log10)的線性曲線。

    問(wèn)題2.4 (5 分)

    計(jì)算抗壞血酸和咖啡提取物的SC50值,并填入答題卡上表格中(你可以利用問(wèn)題2.3 中的格子對(duì)咖啡萃取液作一條線性曲線,但該曲線并不算分)。

    抗壞血酸 咖啡萃取物SC50

    問(wèn)題2.5 (3 分)

    使用相同的方法, 某2 個(gè)咖啡品種提取物的SC50的值如下:

    咖啡提取物 SC50 X 3.8 mg/mL Y 2.6 mg/mL

    比較包括本實(shí)驗(yàn)中咖啡豆(Z)的抗氧化活性,依據(jù)從強(qiáng)到弱的順序, 把不同類型的咖啡豆填入下表的空格處。

    >>

    問(wèn)題2.6 (4 分)

    假設(shè)你在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同稀釋度的咖啡提取物和DPPH 混合物的吸光度非常接近, 差異可忽略不計(jì)。 請(qǐng)判斷下列陳述是正確還是錯(cuò)誤,用“√”表明。

    A.稀釋后的咖啡提取物的抗氧化活性可以忽略不計(jì)

    B.為了更準(zhǔn)確地測(cè)定抗氧化活性,需要利用更高濃度的樣品進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)

    C.咖啡提取物中存在的抗氧化酶的活性導(dǎo)致了上述結(jié)果

    D.如果孔中存在NADH 污染,其結(jié)果將類似于上述假設(shè)

    問(wèn)題2.7 (4 分)

    一個(gè)學(xué)生使用和你一樣的方法(方法A)測(cè)定了一個(gè)樣品的抗氧化活性。與此同時(shí),他又使用了另一不同方法(方法A*)進(jìn)行測(cè)量。他所得的結(jié)果如下:

    方法A 方法A*SC50(mg/mL) 1.95 3.9

    下列哪些變化可能導(dǎo)致更高的SC50值? 請(qǐng)判斷下列陳述是正確還是錯(cuò)誤,用“√”表明。

    A.該學(xué)生在方法A*中可能使用了0.1 mm 的DPPH

    B.該學(xué)生在方法A*中可能使用了10 μL 的樣品

    C.加入DPPH 后,該學(xué)生將96 孔板孵育的時(shí)間可能比方法A 中的短

    D.該學(xué)生可能使用了對(duì)抗氧劑更好的溶劑

    實(shí)驗(yàn)3 乳酸發(fā)酵(30 分)

    介紹:近日,科學(xué)家分離出越南傳統(tǒng)發(fā)酵芥菜同型酸乳酸桿菌菌株(Lactobacillus sp. VN156)。在該實(shí)驗(yàn)中, 乳酸桿菌VN156 在MRS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。 培養(yǎng)基的初始pH 為5.6。 在培養(yǎng)過(guò)程中的不同時(shí)間點(diǎn)取樣, 測(cè)定細(xì)菌在600 nm 的光密度(OD)(圖3.1)。 樣品A0、A2、A3 和A5 是所收集菌液的上清液,將用于分析乳酸的濃度。

    圖3.1 乳酸桿菌VN156 的生長(zhǎng)曲線

    問(wèn)題3.1 (3 分)

    假設(shè)圖3.1 表示生長(zhǎng)的真實(shí)過(guò)程。 計(jì)算乳酸桿菌VN156 在指數(shù)生長(zhǎng)期的增代時(shí)間(h),將數(shù)值填入答題卡中。

    問(wèn)題3.2 (3 分)

    如果將1 mL,培養(yǎng)9 h 后的菌液稀釋到新鮮的MRS 培養(yǎng)基中,計(jì)算培養(yǎng)6 h 后的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量,記錄在答題卡中。

    pH 計(jì)的校準(zhǔn)。

    使用便攜式pH 計(jì)(圖3.2)測(cè)量pH 值。

    圖3.2 便攜式pH 計(jì)

    步驟1)按照?qǐng)D3.3 中以下步驟校準(zhǔn)pH 計(jì)。

    ·撥動(dòng)ON/OFF 按鈕,打開(kāi)pH 計(jì)。

    ·取下保護(hù)蓋,用清水沖洗電極尖,輕輕地用紙巾擦干。

    ·將電極頭部浸入pH 值7.01 的緩沖溶液中。 確保電極末端完全浸沒(méi)在溶液中(約2 cm 的末端在溶液中)。 等待讀數(shù)穩(wěn)定。

    ·用螺絲刀, 輕輕旋轉(zhuǎn)pH7 微調(diào)螺絲, 直到屏幕上顯示pH 值為7.01。

    ·用水沖洗pH 電極,輕輕地用紙巾擦干。

    ·將電極頭部浸入pH4.01 的緩沖溶液中。等待讀數(shù)穩(wěn)定。

    ·用螺絲刀,輕輕旋轉(zhuǎn)pH4/10 微調(diào)螺絲,直到屏幕上顯示pH 值為4.01。

    ·校準(zhǔn)完成。

    ·注意:如果你關(guān)閉pH 計(jì),再次打開(kāi)使用前應(yīng)重新校準(zhǔn)。

    圖3.3 校準(zhǔn)pH 計(jì)

    乳酸滴定:滴定是一種分析技術(shù),可對(duì)溶解在溶液中的特定物質(zhì)(分析物)進(jìn)行定量測(cè)定。 它基于添加到溶液中、濃度已知的分析物和試劑(滴定劑)之間完全化學(xué)反應(yīng)。 在這一部分實(shí)驗(yàn)中,將通過(guò)滴定方法,用0.1 mol/L 的氫氧化鈉確定樣品中的乳酸濃度,如圖3.4 所示。

    圖3.4 滴定裝置

    問(wèn)題3.3 (2 分)

    根據(jù)問(wèn)題3.2 的結(jié)果計(jì)算所需樣品(mL)和水(mL)的體積,并填入下表中。

    培養(yǎng)時(shí)間(h)樣品稀釋因子樣品體積(mL)去離子水的體積(mL)總體積(mL)0 A0 2 30 6 A2 5 30 9 A3 10 30 15 A5 20 30

    ·根據(jù)你的計(jì)算,在100 mL 的燒杯中對(duì)每個(gè)樣品配制稀釋液。每個(gè)樣品準(zhǔn)備2 個(gè)重復(fù)樣品。請(qǐng)使用25 mL 的量筒移取去離子水,使用微量移液器和10 mL 的量筒中移取樣品。

    ·將一個(gè)磁性攪拌棒小心地放入稀釋的樣品溶液中。 夾緊pH 計(jì),讓電極末端處于溶液中(約2 cm 的末端浸沒(méi)在溶液中), 同時(shí)保證在攪拌的過(guò)程中攪拌子不會(huì)碰到pH 電極。 開(kāi)始進(jìn)行緩慢攪拌并記錄0.1 mol/L NaOH 溶液的起始體積。

    ·小心擰動(dòng)滴定管的活塞,讓NaOH 溶液從管中緩慢滴入燒杯里的樣品中。 當(dāng)pH 樣品變?yōu)橹行裕?.95~7.05)時(shí),停止加入NaOH。 記錄0.1 mol/L NaOH 溶液的剩余終體積。

    ·每次滴定完成后, 小心地從溶液中取出pH電極,用清水沖洗。用鉗子取出攪拌子并用水沖洗。

    ·針對(duì)每個(gè)樣本,重復(fù)步驟2~5。

    問(wèn)題3.4 (9 分)

    記錄用于每個(gè)樣品滴定的0.1 mol/L 氫氧化鈉的體積,記錄在下表中。

    ?

    問(wèn)題3.5 (10 分)

    計(jì)算滴定每個(gè)樣品,30 mL 儲(chǔ)備所需0.1 mol/L NaOH 的平均體積。 計(jì)算每個(gè)樣品中乳酸菌濃度。在下表中記錄所有數(shù)據(jù)。

    培養(yǎng)時(shí)間(h) 樣品 滴定30 mL 儲(chǔ)備樣品用0.1 mol/L NaOH 的體積(mL)乳酸產(chǎn)量(g/L)0 A0 6 A2 9 A3 15 A5

    問(wèn)題3.6 (3 分)

    基于圖3.1,假設(shè)OD600=1 對(duì)應(yīng)于細(xì)胞濃度2×108個(gè)細(xì)胞/mL。 細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量增加2×108個(gè)細(xì)胞/mL, 乳酸的濃度將增加1g/L。 如果培養(yǎng)11 h后的乳酸濃度為6 g/L,計(jì)算細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量(細(xì)胞/mL),并記錄在答題卡中。

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