小麥?zhǔn)吃葱赃^敏原致敏亞基分析

姚亞亞 劉陽星月 李宇凡 苗字葉 劉 壯 李慧靜

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院1，保定 071001) (北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心；北京工商大學(xué)2，北京 100048)

小麥過敏主要是指由小麥致敏蛋白引起的Ⅰ型超敏反應(yīng)[1，2]。在研究小麥蛋白致敏機(jī)理、檢測(cè)方法的建立以及脫敏方法篩選中，關(guān)鍵是了解小麥過敏原。小麥蛋白種類繁多，其中小麥致敏蛋白占大部分，根據(jù)世界衛(wèi)生組織和國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(WHO/IUIS)過敏原命名小組委員，截止到2016年11月29日已批準(zhǔn)13種食源性小麥過敏原[3]，包括抑制蛋白、非特異性脂轉(zhuǎn)換蛋白、同工麥胚凝集素、ω5-醇溶蛋白、α淀粉酶CM17、硫氧還蛋白、高分子量麥谷蛋白、低分子質(zhì)量谷蛋白G1uB3-23、Y-醇溶蛋白、α-嘌呤硫素、線粒體NFKB1的泛素連接酶原激活劑、假定小麥蛋白、胚乳傳遞細(xì)胞特異性PR60前體、延伸因子1，其致敏亞基分子質(zhì)量分布為9.5、12、13、16、17、20、26、27、32～38、39.5、65、83、88 ku的蛋白[4，5]。

目前，國(guó)外對(duì)小麥過敏原的鑒定開展了大量的研究。Sander等[6]以10名小麥致敏面包師患者血清為樣本，其檢測(cè)出IgE的主要結(jié)合蛋白亞基分子量為40、42、26 ku的蛋白。Weiss等[7]通過SDS-PAGE和免疫印跡證明20名對(duì)小麥粉過敏患者的血清含有與70、55、35、26～28、14～18 ku區(qū)域中的許多白蛋白/球蛋白多肽結(jié)合的IgE抗體。Venter等[8]在對(duì)小麥致敏的37名兒童檢測(cè)中，3名(8.1%)對(duì)ω5-醇溶蛋白敏感，1名(2.7%)對(duì)小麥脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白敏感，1名(2.7%)對(duì)麥小麥醇溶蛋白敏感。Nilsson等[9]對(duì)63名被醫(yī)生診斷為患有小麥過敏癥的兒童進(jìn)行致敏組分分析，其中ω-5麥醇溶蛋白，低分子量谷蛋白(LMW-glutenin)和高分子量谷蛋白(HMW-glutenin)以及天然麥醇溶蛋白四種小麥蛋白組分的免疫球蛋白E抗體(IgE-ab)水平顯著較高(P<0.000 1)。

我國(guó)對(duì)小麥過敏原的鑒定方面鮮有報(bào)道，對(duì)引起我國(guó)小麥過敏患者過敏的主要過敏原致敏概率的研究還處于起步階段。朱奕锜等[10]通過檢測(cè)分析10例患有WDEIA的小麥過敏患者，結(jié)果顯示患者對(duì)3-磷酸甘油醛脫氫酶過敏，對(duì)三聚淀粉酶抑制劑、ω-5醇溶和磷酸丙糖異構(gòu)酶等蛋白敏感。冼靜雯等[11]通過分離小麥過敏原和免疫印跡方法對(duì)小麥過敏原免疫學(xué)特性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明23 ku蛋白為主要的小麥過敏原。

師欒02-1小麥作為小麥主產(chǎn)區(qū)主要品種，且其等級(jí)達(dá)到國(guó)標(biāo)一等，具有良好的烘焙等加工品質(zhì)[12]，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇師欒02-1小麥品種做過敏原分析。以我國(guó)12例小麥過敏患者的血清為探針，3例正常人的血清池為對(duì)照，與師欒02-1小麥粉進(jìn)行電泳免疫印跡分析鑒定，引起我國(guó)小麥過敏人群過敏的小麥過敏原及其致敏概率，以期發(fā)現(xiàn)新的小麥過敏原，為后期建立適合引起我國(guó)小麥過敏人群過敏的主要過敏原檢測(cè)技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

師欒02-1小麥(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.93%)，精細(xì)加工成小麥粉；小麥過敏患者血清由中國(guó)解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院和北京軍區(qū)總醫(yī)院提供；小麥正常者血清由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院提供；丙烯酰胺(Acr)；甲叉丙烯酰胺(Bis)；過硫酸銨(AP)；十二烷基磺酸鈉(SDS)；四甲基乙二胺(TEMED)；巰基乙醇；三羥甲基氨基甲烷(Tris)；考馬斯亮藍(lán)(R-250)；牛血清白蛋白(BSA)；標(biāo)準(zhǔn)蛋白；34079型ECL試劑盒；聚偏氟乙烯(PVDF)膜；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

ImmunoCAP 250全自動(dòng)體外免疫檢測(cè)系統(tǒng)；ZNCL-S140X140磁力攪拌器；PHS-3C型PH計(jì)；DYCZ-28A型單板夾芯式垂直電泳儀；Multiskan FC型酶標(biāo)儀；凝膠成像儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

采用正己烷脫脂，小麥粉與正己烷按照1∶2的質(zhì)量體積比例混合，在密閉容器中用攪拌器攪拌4 h后靜置0.5 h，然后將上層黃色液體倒出，之后再按小麥粉∶正己烷1∶2加正己烷，攪拌2 h后靜置0.5 h，倒出上層黃色液體，重復(fù)操作，直到上層液呈無色為止。放置于通風(fēng)櫥干燥。將去脂小麥粉樣品按照1∶20的質(zhì)量體積比例加入樣品緩沖液，提取24 h，于室溫下4 000×g離心20 min，留其上清液，舍棄沉淀，再在10 000×g室溫下離心15 min去除殘存的脂肪和不溶性微粒。采用Bradford法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)濃度，并將在-20 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

采用不連續(xù)SDS-PAGE垂直電泳，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。將所制備樣品于室溫下融化，沸水浴加熱5 min，樣品上樣量為10 μg，電壓待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓調(diào)至160 V，待染料前沿遷移至橡膠框底邊1 cm處，停止電泳。取下凝膠，將凝膠于固定液中固定2 h，傾去固定液，置于考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色液染色2～5 h，傾去染色液，加入脫色液，幾小時(shí)更換一次脫色液，直到凝膠的藍(lán)色背景完全褪去，蛋白質(zhì)的電泳條帶清晰為止。量出溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端的距離(cm)和各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，計(jì)算蛋白質(zhì)樣品相對(duì)遷移率(mR)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

y=-0.717 4x+1.368 6，R2=0.997 5。

1.3.3 小麥過敏患者血清中小麥特異性IgE(sIgE)的測(cè)定

ImmunoCap 250全自動(dòng)體外免疫檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定小麥過敏患者血清中小麥特異性免疫蛋白，判定標(biāo)準(zhǔn)如表1，小麥過敏患者血清在-80 ℃凍存，使用前復(fù)融。

表1 國(guó)際上sIgE含量過敏定級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.4 小麥非過敏患者與小麥粉的免疫印跡(Western-Blotting)

以3例正常人的血清和血清池為樣本，采用免疫印跡技術(shù)進(jìn)行免疫學(xué)特性分析鑒定小麥粉中存在的小麥非過敏原。首先采用不連續(xù)SDS-PAGE垂直電泳，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，進(jìn)行電泳，電泳后再將膠放入電轉(zhuǎn)液浸泡30 min，電轉(zhuǎn)時(shí)，按照墊片、濾紙、PVDF膜、膠、濾紙、墊片的順序組裝在一起，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；將PVDF膜放置于30%BSA中封閉60 min；之后進(jìn)行洗膜，用1×TBST溶液洗滌5次，每次3 min；用3%BSA將血清按照1∶400的比例進(jìn)行稀釋，加入血清，37 ℃孵育2 h；同上洗膜，用1×TBST溶液洗滌5次，每次3 min；再加入用3%BSA將血清按照1∶5 000的比例進(jìn)行稀釋的二抗，置于搖床上37 ℃孵育1 h，同上洗膜5次后將ECL試劑盒中A液和B液按照1∶1比例混合取1 mL置于PVDF膜上；顯影、定影后攝像分析相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.5 小麥過敏患者與小麥粉的免疫印跡(Western blotting)

世界衛(wèi)生組織和國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(WHO/IUIS)過敏原命名小組委員要求能夠加入過敏原的官方列表標(biāo)準(zhǔn)為至少需要5例過敏患者血清[3]。采用免疫印跡技術(shù)對(duì)12例小麥過敏患者血清與小麥粉蛋白進(jìn)行免疫學(xué)特性分析鑒定小麥粉中存在的小麥過敏原。其余步驟同1.3.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥粉SDS-PAGE

小麥粉SDS-PAGE圖譜(圖1)結(jié)果表明小麥粉含有豐富的蛋白亞基，其主要亞基分子量分布為117、97、83、72、69、64、62、58、54、43、40、37、27、26、25、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12 ku，其條帶的深淺代表亞基含量的高低。Akagawa等[13]利用SDS-PAGE分析了小麥粉中的全蛋白亞基分布，其亞基分布與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。小麥粉中蛋白含量豐富，是人們獲取蛋白營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來源，但其蛋白可能為潛在的過敏原，對(duì)小麥過敏患者產(chǎn)生健康危害。因此，明確具體的過敏原，鑒定致敏概率是為建立適合引起我國(guó)小麥過敏人群過敏的主要過敏原檢測(cè)技術(shù)提供參考。

圖1 小麥粉SDS-PAGE圖譜

2.2 小麥過敏患者sIgE水平

由表2可知，在12例小麥過敏患者中，大部分患者屬于陽性等級(jí)，占91.7%，弱陽性占8.3%。朱奕锜等[10]針對(duì)10名患有小麥依賴-運(yùn)動(dòng)誘發(fā)過敏反應(yīng)(WDEIA)進(jìn)行小麥過敏原sIgE檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，50%患者為陽性，10%為強(qiáng)陽性，30%為弱陽性，與本結(jié)果幾乎一致。尹佳等[14]測(cè)定了15例WDEIA患者的sIgE，結(jié)果同樣表明大部分患者為陽性等級(jí)，其比例達(dá)到86.7%。Lee等[15]通過ImmunoCAP分析了6例小麥過敏患者血清sIgE，結(jié)果表明6例患者中33.3%屬弱陽性范圍，66.7%屬陽性等級(jí)。與本結(jié)果基本一致，因此本實(shí)驗(yàn)所選擇的12例血清具有代表性，可進(jìn)行進(jìn)一步分析。

表2 小麥過敏患者sIgE水平

2.3 小麥粉非過敏患者血清免疫印跡圖譜分析

由于過敏原的識(shí)別存在非特異性吸附造成結(jié)果為假陽性，盡管在實(shí)驗(yàn)過程中加入牛血清白蛋白作為封閉液消除，但人的血清樣本中會(huì)存在一些非特異性干擾物質(zhì)，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[16，17]。因此，首先要排除過敏原假陽性結(jié)果，為后期過敏患者血清免疫印跡結(jié)果的可靠性，選擇3例非過敏患者血清的血清池作為陰性對(duì)照，由圖2可知，3例正常血清池免疫結(jié)果表明分子量49、42、39 ku亞基為非過敏原。

圖2 小麥粉與小麥非過敏患者血清池反應(yīng)的免疫印跡圖

2.4 小麥粉過敏患者血清免疫印跡圖譜分析

注：1～10分別為10、15、25、35、40、55、70、100、130、170 ku。圖3 小麥粉與小麥過敏患者血清反應(yīng)的免疫印跡圖

以我國(guó)12例小麥過敏患者的血清和血清池樣本為探針，3例正常人的血清和血清池樣本為對(duì)照，進(jìn)行小麥過敏者血清與還原態(tài)一維電泳分離的小麥粉的免疫印跡反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明引起我國(guó)小麥過敏患者過敏的小麥過敏原包括288、230、207、193、188、166、156、135、134、125、118、113、112、109、106、103、101、100、94、83、81、79、75、73、72、69、68、67、66、63、62、60、58、57、56、54、52、50、49、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10 ku等亞基；這些亞基致敏概率自高至低依次為17 ku(6/12)、28 ku(6/12)、14 ku(5/12)、19 ku(5/12)、22 ku(5/12)、24 ku(5/12)、25 ku(5/12)、26 ku(5/12)、11 ku(4/12)、12 ku(4/12)、16 ku(4/12)、21 ku(4/12)、27 ku(4/12)、18 ku(3/12)、30 ku(3/12)、31 ku(3/12)、36 ku(3/12)、47 ku(3/12)、83 ku(3/12)，其他亞基致敏概率為1/6或1/12。

用12種不同血清獲得的IgE免疫印跡在識(shí)別的過敏原中顯示顯著的差異性，每名小麥粉患者表現(xiàn)出不同過敏原斑點(diǎn)的個(gè)體敏化模式(表3)。對(duì)于大多數(shù)過敏原來源，針對(duì)不同個(gè)體建立的IgE結(jié)合模式在常見或主要過敏原存在的基礎(chǔ)上非常相似，偶爾存在罕見或次要過敏原，抗體應(yīng)答的個(gè)體差異可能是由于患者的傾向或單變應(yīng)原的可變暴露水平[18]。Sander等[6]以10名小麥致敏面包師患者血清，通過二維電泳免疫印跡分析，結(jié)果顯示，10種不同血清獲得的IgE免疫印跡呈現(xiàn)顯著的差異性，每位患者都顯示出一種單獨(dú)的IgE結(jié)合模式，其中有4至50種不同的過敏原斑點(diǎn)，總共檢測(cè)到100多種IgE結(jié)合蛋白斑點(diǎn)，其檢測(cè)出IgE的主要結(jié)合蛋白亞基分子量為40、42、26 ku的蛋白，與本實(shí)驗(yàn)所鑒定42 kD為非特異性免疫蛋白存在差異，此差異可能源于不同個(gè)體人群免疫水平的差異。Weiss等[7]通過SDS-PAGE和免疫印跡證明20名對(duì)小麥粉過敏患者的血清含有與70、55、35、26～28、14～18ku區(qū)域中的許多白蛋白/球蛋白多肽結(jié)合的IgE抗體，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果除了70、55 ku，其余致敏亞基與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，該差異可能由于所用血清樣本及所選小麥品種不同。

表3 小麥粉與小麥過敏者血清的免疫印跡圖致敏亞基分子質(zhì)量分析結(jié)果/ku

注：每列序號(hào)與免疫印跡圖3序號(hào)一致。

3 結(jié)論

以我國(guó)12例小麥過敏患者的血清為探針，3例正常人的血清池為對(duì)照，與師欒02-1小麥粉進(jìn)行還原態(tài)一維電泳免疫印跡分析鑒定引起我國(guó)小麥過敏人群過敏的小麥過敏原及其致敏概率。鑒定結(jié)果表明，小麥過敏原蛋白亞基的致敏概率自高至低的順序依次為17 ku(6/12)、28 ku(6/12)、14 ku(5/12)、19 ku(5/12)、22 ku(5/12)、24 ku(5/12)、25 ku(5/12)、26 ku(5/12)、11 ku(4/12)、12 ku(4/12)、16 ku(4/12)、21 ku(4/12)、27 ku(4/12)、18 ku(3/12)、30 ku(3/12)、31 ku(3/12)、36 ku(3/12)、47 ku(3/12)、83 ku(3/12)，其他亞基致敏概率為1/6或1/12。

目前，市場(chǎng)上過敏原檢測(cè)試劑盒主要為進(jìn)口試劑盒，國(guó)內(nèi)公司試劑盒的研制大多是基于引起外國(guó)人群過敏的小麥過敏原進(jìn)行開發(fā)。然而，本研究結(jié)果表明不同人群過敏原分布差距較大，故急需開發(fā)適合我國(guó)小麥過敏人群得檢測(cè)方法。本研究為建立適合引起我國(guó)小麥過敏人群過敏的主要過敏原檢測(cè)方法提供了借鑒。