交泰丸含藥血清對(duì)離體豚鼠心室肌細(xì)胞膜動(dòng)作電位的影響*

陳召起，邢作英，王永霞，朱明軍，胡宇才，陳 鵬，宋歡歡，鄭 佳，任紅杰

(1. 河南省人民醫(yī)院中醫(yī)科，河南 鄭州450003； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心，河南 鄭州 450000)

交泰丸一方首見于明代韓懋《韓氏醫(yī)通》一書。該書最早記載：“黃連……生用為君，佐官桂少許，煎百沸，入蜜，空心服，能使心腎交于頃刻?！鼻宕跏啃鄣摹端目坪?jiǎn)效方》始出交泰丸方名，標(biāo)明黃連肉桂之比為10∶1，有清心除煩、引火歸元、交通心腎的作用，對(duì)心腎不交之心悸療效顯著。早期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)交泰丸對(duì)室性早搏[1]及多種原因引起的快速性心律失常有效[2]。目前交泰丸在臨床主要被用于病機(jī)為心火亢盛、心腎不交之心悸。本實(shí)驗(yàn)研究了交泰丸含藥血清對(duì)離體豚鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響，探討桂枝甘草湯抗心律失常的藥理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

健康SD大鼠20只，雄性，體質(zhì)量250～350 g，8～12周齡，SPF級(jí)，合格證號(hào)為SCXK(京)2010-0001，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)。健康成年豚鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量250～350 g，10～12周齡，清潔級(jí)，合格證號(hào)為SCXK(京)2011-0004，由北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)。

1.2 藥品、主要試劑與儀器

黃連(批號(hào)20130725)、肉桂(批號(hào)20130512)，均為江陰天江藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供，交泰丸中黃連、肉桂的比例為10∶1。氯化鈉(NaCl，批號(hào)100997803)、氯化鉀(KCl，批號(hào)1000959400)、氯化鈣(CaCl2，批號(hào)10035-04-8)、葡萄糖(Glucose，批號(hào)1000898954)、羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，批號(hào)1001531694)、左旋谷氨酸(L-Glutamic Acid，批號(hào)1000985138)、硫酸鎂(MgSO4，批號(hào)1001386591)、氯化鎂(MgCl2，批號(hào)1000838831)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA，批號(hào)1000960158)、?；撬?Taurine，批號(hào)1001675865)等，由SIGMA公司提供；Ⅱ型膠原酶(127 500 units/L，批號(hào)17101-015)、細(xì)胞培養(yǎng)基(Media 199，批號(hào)1221478)等，由GIBCO公司提供。Langendorff灌流系統(tǒng)，自制；EPC-10膜片鉗系統(tǒng)，德國(guó)HEKA公司產(chǎn)品；OLYMPUS IX71倒置顯微鏡，產(chǎn)地日本；PatchMaster軟件，德國(guó)HEKA產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組與含藥血清制備

將20只大鼠隨機(jī)分為黃連組、肉桂組、黃連+肉桂組、交泰丸組和空白組(給予等容積生理鹽水)5組，每組4只。灌胃藥物：按照《四科簡(jiǎn)效方》交泰丸原方比例黃連∶肉桂(10∶1)配伍[3]，取黃連100 g、肉桂10 g，合并煎煮，得到交泰丸組藥液。另取黃連100 g、肉桂10 g，分別煎煮，制備黃連組和肉桂組藥液。黃連煎液和肉桂煎液以1∶1比例混合，得到黃連加肉桂組藥液。各組煎煮濾液濃縮至100 mL，以10 μL/g 體質(zhì)量的劑量灌胃給予大鼠，灌胃藥量分別為成人的5倍劑量，每日2次；空白組給予等容積生理鹽水。末次給藥1 h后，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 g/L水合氯醛40 μg/g麻醉，下腔靜脈采血，4 ℃ 冰箱放置3 h，3 000 r/m離心15 min，收集血清，置-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹3]。大鼠采血完成后棄去不用。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

分離豚鼠心室肌細(xì)胞，Langendorff心臟灌流裝置出口溫度調(diào)整為37 ℃，流速為3～4 mL/min。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 g/L水合氯醛30 μg/g麻醉豚鼠，開胸游離并剪取心臟。修剪后逆行插管連于灌流裝置上，先以Buffer B (Buffer A加1 mol/L CaCl2，調(diào)至1.5 mmol/L) 灌流3 min以去除心臟內(nèi)殘留血液，再以Buffer A (NaCl 136 mmol/L 、KCl 5.4 mmol/L、K2HPO4·2H2O 0.33 mmol/L、MgSO4·7H2O 1.0 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L，1 mol/L NaOH 25 ℃下調(diào)pH值至7.3～7.4) 灌流1 min去除鈣，后改為酶液 (Buffer A 50 mL 、 膠原酶II 25 mg、BDM 25 mg、Carnitine 20 mg、Taurine 31 mg、L-Glutamic Acid 20 mg)，進(jìn)液約10 mL后酶液循環(huán)灌流消化心臟，20 min左右液體拉絲逐漸減少直至結(jié)束，心臟松軟提示消化完成。剪取心室組織放于KB液(KOH 80 mmol/L、KCl 30 mmol/L、L-Glutamic Acid 50 mmol/L、MgCl21 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、KH2PO420 mmol/L、Taurine 20 mmol/L、EGTA 0.5 mmol/L，1 mol/L KOH 25 ℃下調(diào)pH值至7.3～7.4)中，剪碎成細(xì)小組織塊，用吸管吹打，使細(xì)胞分離，細(xì)胞液用200目濾網(wǎng)過(guò)濾后備用。實(shí)驗(yàn)中分別加入各組含藥血清，體積分?jǐn)?shù)為100 mL/L和150 mL/L，置于細(xì)胞孵育箱中24 h后進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)[4]，測(cè)量各組細(xì)胞動(dòng)作電位。檢測(cè)指標(biāo)包括：靜息電位(restingpoten-tial,RP)、動(dòng)作電位幅值(amplitude of action potential,APA)、動(dòng)作電位 0相最大上升速率(maximal velocity of phase 0 depolarization,Vmax)、動(dòng)作電位復(fù)極50%時(shí)程(action potential duration at 50% repolarization,APD50)、動(dòng)作電位復(fù)極90%時(shí)程(action potential duration at 90% repo-larization,APD90)、動(dòng)作電位復(fù)極時(shí)程(action potential repolarization duration,APD)。

膜片鉗實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃左右，取出細(xì)胞，加入細(xì)胞外液 (NaCl 140 mmol/L、KCl 3.5 mmol/L、CaCl22 mmol/L、MgCl21 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、NaH2PO41.25 mmol/L，1mol/L NaOH溶液25 ℃下調(diào)pH值至7.4)。拉制玻璃電極，充灌電極內(nèi)液 (NaCl 5 mmol/L、K-Gluconate 140 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、EGTA 5 mmol/L、Mg-ATP 2 mmol/L、CaCl20.1 mmol/L，1 mol/L KOH溶液25 ℃下調(diào)pH值至7.2)，顯微鏡下選取完整、橫紋清晰的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

各組RP、APA、Vmax、APD50、APD90、APD對(duì)比見表1。

表1各組動(dòng)作電位的對(duì)比

組 別RP/mvAPA/mvVmax/ (V·s-1)APD50/ msAPD90/msAPD/ms100 mL/L空白組-78.62±1.17140.20±0.55232.10±35.92590.20±60.76646.20±35.24650.20±34.54100 mL/L黃連組-76.69±2.65139.40±2.37267.30±22.98605.50±40.09668.00±49.10666.30±48.59100 mL/L肉桂組 -79.50±1.77138.10±3.44183.50±8.33658.40±39.21697.60±37.15714.60±40.01100 mL/L黃連+肉桂組-61.91±3.72*#△130.30±2.55*#102.10±6.73*#754.20±54.26788.20±53.99805.40±56.02100 mL/L交泰丸組-72.38±0.91130.60±1.71*#134.60±8.43#752.20±51.81764.50±47.01793.30±53.95150 mL/L空白組-81.13±0.64142.10±0.79292.90±27.39550.30±55.78502.70±34.70557.60±44.08150 mL/L黃連組-82.88±0.79139.20±1.04253.60±11.38622.50±37.59669.90±76.52713.30±27.94150 mL/L肉桂組-83.88±1.25142.60±0.85243.30±14.50723.60±45.33751.90±33.32*799.20±40.15*150 mL/L黃連+肉桂組-81.63±0.91128.60±3.56*#△179.30±12.96*760.40±46.73*776.20±54.24*806.80±35.81*150 mL/L交泰丸組-79.38±1.32△130.60±3.62*△210.70±14.33*776.70±36.14*858.70±55.68*824.60±42.70*

注：與空白組對(duì)比，*P<0.05；與黃連組對(duì)比，#P<0.05；與肉桂組對(duì)比，△P<0.05；與黃連加肉桂組對(duì)比，＊P<0.05

對(duì)RP的影響：各組藥物對(duì)RP絕對(duì)值呈抑制趨勢(shì)。其中100mL/L黃連+肉桂組抑制最顯著(P<0.05)，且與黃連組和肉桂組的組間對(duì)比差別亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；150 mL/L組各組與空白組對(duì)比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對(duì)APA的影響：各組藥物均抑制APA。其中100 mL/L、150 mL/L交泰丸組和黃連+肉桂組與空白組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。150 mL/L黃連+肉桂組抑制率最大，為9.5%。100 mL/L交泰丸組、黃連+肉桂組分別與黃連組對(duì)比，差別亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

對(duì)動(dòng)作電位Vmax的影響：除100 mL/L黃連增大動(dòng)作電位Vmax外，其余各藥物均抑制APA。其中100 mL/L、150 mL/L黃連+肉桂組，150 mL/L交泰丸組與空白組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；100 mL/L黃連+肉桂組、100 mL/L交泰丸組與100 mL/L黃連組對(duì)比，差別亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P<0.05)；100 mL/L黃連+肉桂組抑制率最大，為56.0% 。

對(duì)APD50的影響：各藥物均延長(zhǎng)APD50。其中150 mL/L黃連+肉桂組、150 mL/L交泰丸組與空白組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；150 mL/L交泰丸組延長(zhǎng)率最大，為41.1%。

對(duì)APD90的影響：各藥物均延長(zhǎng)APD90。其中150 mL/L肉桂組、150 mL/L黃連+肉桂組、150 mL/L交泰丸組與空白組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；150 mL/L交泰丸組延長(zhǎng)率最大，為70.8%。

對(duì)APD的影響：各藥物均延長(zhǎng)APD。其中150 mL/L肉桂組、150 mL/L黃連+肉桂組、150 mL/L交泰丸組與空白組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；150 mL/L交泰丸組延長(zhǎng)率最大，為47.9%。

3 討 論

黃連主要成分小檗堿有明顯抗心律失常作用，能防治烏頭堿、電刺激及冠狀動(dòng)脈結(jié)扎所致的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室性心律失常，且呈明顯的量效關(guān)系，還能拮抗腎上腺素及其同類物等在麻醉兔身上引起的心律不齊、心率變慢和心電圖的改變[6-8]。肉桂的主要成分桂皮醇具有抗炎、抗氧化及抑制活性氧生成作用。文獻(xiàn)[9]報(bào)道，肉桂水煎劑對(duì)全身血管有擴(kuò)張作用；桂皮油對(duì)兔離體心臟有抑制作用，對(duì)末梢血管有持續(xù)性擴(kuò)張作用。

本研究結(jié)果顯示：100 mL/L黃連+肉桂組抑制RMP、APA最顯著(P<0.05)，且對(duì)Vmax抑制率最大(P<0.05)；150 mL/L交泰丸組對(duì)APD50、APD90和APD延長(zhǎng)率最大。細(xì)胞靜息膜電位是內(nèi)向整流鉀電流(IK1)平衡運(yùn)動(dòng)的結(jié)果，用藥后RMP絕對(duì)值減小，提示藥物可能具有抑制IK1的作用；鈉離子(Na+)快速內(nèi)流形成快速除極期，藥物抑制APA和Vmax，提示藥物可能通過(guò)抑制INa減慢沖動(dòng)在細(xì)胞間的傳導(dǎo)，消除折返發(fā)揮抗心律失常的作用。動(dòng)作電位復(fù)極過(guò)程是鈣離子內(nèi)流和鉀離子外流相互作用的結(jié)果，使用藥物后APD50、APD90和APD不同程度延長(zhǎng)，提示藥物可能起到抑制ICa-L和IK的作用，從而延長(zhǎng)不應(yīng)期，提高異常沖動(dòng)落入有效不應(yīng)期的概率，有效減少異常沖動(dòng)的傳導(dǎo)，對(duì)快速性心律失常的治療有一定價(jià)值[10-12]。

對(duì)比各組藥物的藥理效應(yīng)發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)挝端幬锿ㄟ^(guò)一定方法加減組合后，藥效優(yōu)于單味藥物的單獨(dú)應(yīng)用。提示：中藥獨(dú)特療效有其獨(dú)特的物質(zhì)基礎(chǔ)，復(fù)方藥物加減組合后有一定協(xié)同作用，增強(qiáng)了藥物的原有療效，是中藥配伍方法“相須”的體現(xiàn)。

綜上所述，延長(zhǎng)細(xì)胞動(dòng)作電位的APD50、APD90和APD是交泰丸發(fā)揮抗心律失常作用的重要電生理機(jī)制。此為做進(jìn)一步藥效物質(zhì)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為交泰丸復(fù)方的臨床應(yīng)用提供了參考。