紅花配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究*

王曉偉，劉瑞新，石 巖

(1. 河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450008； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州450000； 3.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

紅花為菊科紅花屬植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，是常用的活血化瘀中藥材之一，適用于經(jīng)閉、痛經(jīng)、胸痹心痛、跌撲損傷、瘡瘍腫痛等證[1]。羥基紅花黃色素A、山柰素、槲皮素等黃酮類(lèi)成分是紅花中的一類(lèi)主要活性成分[2]?，F(xiàn)行2015版《中國(guó)藥典》一部紅花藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，不僅檢測(cè)了其羥基紅花黃色素A的含量，也對(duì)其山柰素的含量進(jìn)行了控制[3]。紅花配方顆粒是由紅花單味中藥飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成，具有免煎易服、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)。已有文獻(xiàn)[4]報(bào)道了紅花配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，但僅對(duì)羥基紅花黃色素A含量進(jìn)行了測(cè)定。為有效控制紅花配方顆粒的質(zhì)量，筆者以2015版《中國(guó)藥典》一部中紅花項(xiàng)下相關(guān)內(nèi)容為依據(jù)，參考《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見(jiàn)稿)》，建立薄層色譜法對(duì)紅花配方顆粒進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法對(duì)紅花配方顆粒中的山柰素進(jìn)行含量測(cè)定。

1 藥品、試劑與儀器

紅花配方顆粒共9批，來(lái)自X，F(xiàn)和W三家生產(chǎn)企業(yè)，具體見(jiàn)表1。山柰素對(duì)照品(純度93.2%，批號(hào)110861-201310)、紅花對(duì)照藥材(批號(hào)120907-201713)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇，為色譜純，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；水為超純水；其他試劑為分析純。硅膠G預(yù)制薄層色譜板購(gòu)自青島海洋化工廠和煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所。色譜柱Phenomenex Luna (250 mm×4.6 mm，5 μm)、YMC-Pack ODS-A(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。LC-20A高效液相色譜儀，SHIMADZU公司產(chǎn)品；SIGMA3-30ks高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品； Digistore薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)，CAMAG公司產(chǎn)品；XPE205電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；GZX-DH-400-BSII電熱恒溫干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；IKA C-MAG HP 7加熱器，IKA公司產(chǎn)品；XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；KQ-300型超聲波儀，江蘇昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層特征鑒別

取本品1 g，加水20 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

另取紅花對(duì)照藥材2 g，加水50 mL，煮沸30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至20 mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，同法制成對(duì)照藥材溶液。按《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》中藥飲片煎煮方法相關(guān)操作規(guī)范規(guī)定，制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑溶液。取紅花飲片，稱(chēng)取紅花飲片100 g，采用砂鍋煎煮兩次：第1次加水1 400 mL，浸泡30 min，先用武火煮沸再改用文火煎煮30 min；第2次加水1 000 mL，煎煮20 min。合并兩次煎煮液，濾過(guò)，取濾液60 mL蒸干，同供試品制備方法，制成標(biāo)準(zhǔn)湯劑溶液。

吸取供試品及標(biāo)準(zhǔn)湯劑溶液各6 μL、紅花對(duì)照藥材溶液3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-甲醇(3∶7∶1∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，熱風(fēng)吹干，置紫外光燈(365 nm)下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖1。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)，且與標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜斑點(diǎn)保持一致。

1．紅花對(duì)照藥材； 2．供試品(批號(hào)04215101)； 3．標(biāo)準(zhǔn)湯劑圖1 紅花TLC鑒別圖譜

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件的選擇

色譜柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-4 mL/L磷酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為367 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按山柰素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液的制備：取山柰素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成1 mL含10 μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取裝量差異項(xiàng)下的本品，混勻，取約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液15 mL，置平底燒瓶中，加鹽酸溶液(15→37)5 mL,搖勻，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性樣品溶液的制備：按處方比例稱(chēng)取輔料同法制成陰性樣品，并按照供試品的處理方法制備缺紅花的陰性樣品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺紅花陰性樣品溶液各10 μL，進(jìn)樣。結(jié)果表明，陰性樣品色譜中在與山柰素相應(yīng)的保留時(shí)間沒(méi)有色譜峰，表明輔料對(duì)山柰素的測(cè)定無(wú)干擾，以本法測(cè)定本品中山柰素的含量具有專(zhuān)屬性，見(jiàn)圖2。

A.供試品；B.對(duì)照品；C.陰性樣品圖2 供試品、對(duì)照品和陰性樣品HPLC對(duì)比圖

線性關(guān)系的考察：精密稱(chēng)取山柰素對(duì)照品6.16 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇適量超聲處理使溶解，取出，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為114.822 4 mg/L的山柰素對(duì)照品貯備液；精密量取0.1，0.3，0.5，1，3，5 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.148 224，3.444 672，5.741 120，11.482 240，34.446 720，57.411 200 mg/L的對(duì)照品溶液；精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=4 603 113.999 5X-8 444.818 2，r=0.999 99。結(jié)果表明：山柰素在0.011 48～0.574 11 μg范圍內(nèi)線性良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一供試品(批號(hào)04215101)溶液10 μL，重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)精密度。結(jié)果：RSD為0.28%。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品(批號(hào)04215101)，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液的制備和測(cè)定法項(xiàng)下操作，分別在制備后放置0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果：RSD為0.24%。結(jié)果表明：供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取供試品(批號(hào)04215101)，按2.2.2項(xiàng)下方法分別制備6份，測(cè)定山柰素的含量。結(jié)果：平均含量為0.913 2 mg/g，RSD為0.33%。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱(chēng)取山柰素對(duì)照品5.05 mg，置10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.023 5 g/L對(duì)照品溶液。精密量取5，10，15 mL(各3份)，分別置具塞錐形瓶中。取樣品(批號(hào)04215101)適量，研細(xì)，取約 0.25 g，精密稱(chēng)定，置上述具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇20，15，10 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理(功率250W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液15 mL，置平底燒瓶中，加鹽酸溶液(15→37)5 mL，搖勻，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液10 μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2山柰素加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

n=9

色譜柱耐用性試驗(yàn)：分別使用3種不同品牌的色譜柱，即Phenomenex Luna (250 mm×4.6 mm，5 μm) 、YMC-Pack ODS-A (250 mm×4.6 mm，5 μm)和Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)對(duì)同一批樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：山柰素RSD為0.91%。結(jié)果表明：本法色譜柱耐用性良好。

樣品含量測(cè)定：按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定9批樣品中山柰素的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表39批樣品山柰素含量測(cè)定結(jié)果

批號(hào)含量/(mg·g-1)042151010.913 2042151020.701 9042151030.767 4201807010.690 6201807020.737 1201807030.821 51805010.660 41805020.685 21805030.676 3

按2.1項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按2015版《中國(guó)藥典》一部紅花項(xiàng)下山柰素含量測(cè)定方法，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)湯劑及其制備原料紅花飲片的山柰素含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測(cè)定結(jié)果

按2015版《中國(guó)藥典》一部紅花項(xiàng)下山柰素含量測(cè)定方法，測(cè)定X廠家所提供3批配方顆粒樣品原料紅花飲片的山柰素含量，并計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 3批樣品山柰素含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

在研究薄層色譜鑒別方法時(shí)，考察了直接用800 mL/L丙酮提取的樣品處理方法，但是這樣處理后供試品色譜分離效果較差，而使用本文方法則能較好地去除拖尾，有效地提升了色譜分離效果。同時(shí)也考察了不噴三氯化鋁試液，展開(kāi)晾干后直接置紫外光燈(365 nm)下檢視，但供試品譜中疑似羥基紅花黃色素A黃色斑點(diǎn)沒(méi)有出現(xiàn)，故仍采用噴以氯化鋁試液，加熱后置紫外光燈(365 nm)下檢視的方法。供試品色譜中黃色斑點(diǎn)是否為羥基紅花黃色素A，有待進(jìn)一步確認(rèn)。另外，在實(shí)驗(yàn)中，曾試用了不同廠家制備的硅膠G板，在不同的溫度和相對(duì)濕度條件下展開(kāi)，結(jié)果本文所建立的紅花的鑒別方法鑒別特征清晰，對(duì)不同的層析條件耐用性較好，可作為樣品中紅花的定性鑒別方法。

在研究山柰素的含量測(cè)定方法時(shí)，分別考察了不同的提取溶劑(甲醇、800 mL/L甲醇水溶液、500 mL/L甲醇水溶液)、不同的提取方法(超聲提取法、加熱回流提取法、振搖提取法)、不同提取時(shí)間(15，30，45 min)，以及不同提取液與取樣量比例(500，200，100，50，25倍)。最終，根據(jù)提取的效率與提取完全程度確定了文中的樣品提取方法。

配方顆粒是以飲片為原料經(jīng)水煎煮提取，濃縮，干燥并加適當(dāng)輔料制成的顆粒，很好的解決了標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮耗時(shí)且服用量大等問(wèn)題，其臨床應(yīng)用日漸廣泛[5]。然而由于不同廠家所選用飲片原料和生產(chǎn)工藝不同，一品多家的配方顆粒其內(nèi)在質(zhì)量差異也較大。筆者測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)湯劑、3批配方顆粒樣品及飲片原料中山柰素的含量，其中X廠家配方顆粒的整體轉(zhuǎn)移率高于標(biāo)準(zhǔn)湯劑，但在生產(chǎn)工藝相同條件下，其不同批次產(chǎn)品轉(zhuǎn)移率仍存在較大差異，提示配方顆粒的質(zhì)控中原料應(yīng)是權(quán)重最大的因素。本次研究受研究時(shí)限和樣本數(shù)量限制，結(jié)論也不可避免地會(huì)有所偏差，因此這些結(jié)論尚需收集更大樣本量進(jìn)行分析和驗(yàn)證。至于配方顆粒能否代替標(biāo)準(zhǔn)湯劑的臨床應(yīng)用，仍待進(jìn)一步的研究。