添加腸道微生態(tài)制劑對于早產(chǎn)兒腸道菌群影響的研究

樊 娟 劉 華 田鸞英

深圳市南山區(qū)婦幼保健院兒科，廣東深圳 518067

每個新生兒都有其獨特的腸道微生物菌群圖譜，腸道菌群定植也是一個復(fù)雜的過程[1]。有研究表明，早產(chǎn)兒胃腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂，多態(tài)性薄弱，能擾亂腸道正常功能，導(dǎo)致健康菌群定植明顯延遲，從而使早產(chǎn)兒致病菌定植增加、 免疫功能發(fā)育不健全以及感染增加，嚴重影響個體發(fā)育[2-3]。本研究通過Illumina HiSeq高通量測序平臺，分析選取的2015年7月～2016年7月于深圳市南山區(qū)婦幼保健院新生兒科住院早產(chǎn)兒病例，探討添加腸道微生態(tài)制劑對于早期早產(chǎn)兒腸道菌群的影響，進而證實盡早添加腸道微生態(tài)制劑有助于早產(chǎn)兒腸道有益菌的定植并促進其后期生長發(fā)育及健康。

表1 早產(chǎn)兒基本情況

1 對象與方法

1.1 對象

所有新生兒糞便標本均來源于深圳市南山區(qū)婦幼保健院新生兒病房，由1人收集。選取2015年7月～2016年7月在我院新生兒科住院早產(chǎn)兒，胎齡 32～34 周，出生體重在 1.5kg～2.5kg，母親產(chǎn)前1月未使用抗生素及微生態(tài)制劑，產(chǎn)時無感染，患兒出生時無缺氧窒息等搶救病史并且未使用抗生素，生后混合喂養(yǎng)病例。選取45例患兒，隨機分為g1、g2及g0組，因部分患兒失訪或治療過程因病情變化，從研究組中剔除，最終每組有6例患兒入組。每名患兒留取，生后 1d（t0）、7d（t1）、14d（t2）3個時間段大便標本。g1組生后即加用口服腸道微生態(tài)制劑雙歧桿菌（0.5次，3次/d），療程1周，g2組生后1周加用口服腸道微生態(tài)制劑雙歧桿菌（0.5次，3次/d），g0組不添加腸道微生態(tài)制劑。對所選取3組早產(chǎn)兒病例從胎齡、性別、體重進行分析，均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

1.2 方法

1.2.1 研究設(shè)計 本研究采集生后不同時間段添加益生菌的早產(chǎn)兒生后固定時間點標本，通過Illumina HiSeq高通量測序技術(shù)分析早期早產(chǎn)兒腸道內(nèi)有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌含量的變化。

1.2.2 總DNA提取及PCR擴增 采用 CTAB方法對樣本的基因組 DNA 進行提取，使用無菌水稀釋樣品至1ng/μL。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶 Barcode 的特異引物，New England Biolabs 公司的 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。引物對應(yīng)區(qū)域：16S V4區(qū)引物（515F和806R）：此外，擴增區(qū)域還包 括：16S V3-V4/16S V4-V5；古 菌 16S V4；18S V9和ITS2區(qū)。

1.2.3 文庫構(gòu)建和上機測序 使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序[4]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 早產(chǎn)兒腸道菌群結(jié)構(gòu)

本研究共檢出4個菌門為主：變形菌門（Proteobacteria），硬壁菌門（Firmicutes），類桿菌門（Bacteroidetes），放線菌門（Actinobacteria），且 3 個時間段均以變形菌門及硬壁菌門為主。

2.2 2菌群與口服腸道徽生態(tài)制劑的交互作用

2菌群均與口服腸道微生態(tài)制劑時間有交互作用，乳酸桿菌（F=7.48，P=0.006），雙歧桿菌（F=6.91，P＜0.001），不同菌群不同時刻變化趨勢不一致。見圖1。

圖1 2菌群分布輪廓圖（A.乳酸桿菌；B雙歧桿菌）

2.3 乳酸桿菌分布單獨效應(yīng)

乳酸桿菌分布固定組別單獨效應(yīng)見圖1-A。g0、g1、g2組：菌落分布均呈逐漸上升趨勢。乳酸桿菌分布固定時刻單獨效應(yīng)見表2。0時刻：3組標本在生后24h內(nèi)均未檢測出乳酸桿菌，可能與出生時含量少有關(guān)，當(dāng)然也不能排除DNA提取的問題；1周組：g0，g1，g2菌落分布三組間總的有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05；2周組：g0，g1，g2菌落分布三組間總的有統(tǒng)計學(xué)差異，g1/g2組較g0組含量明顯升高，P＜0.05，g1組較g2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 t0、t1、t2不同時刻乳酸桿菌組間重復(fù)測量分析（n=18）

表3 t0、t1、t2不同時刻雙歧桿菌組間重復(fù)測量分析（n=18）

2.4 雙歧桿菌分布單獨效應(yīng)

雙歧桿菌分布固定組別的單獨效應(yīng)見圖1-B。g0、g1、g2組：菌落分布均呈逐漸上升趨勢。雙歧桿菌分布分布固定時刻的單獨效應(yīng)見表3。0時組：g0，g1，g2菌落分布三組間無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05；1周組：g0，g1，g2菌落分布三組間總的有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05；2周組：g0，g1，g2菌落分布三組間總的有統(tǒng)計學(xué)差異，g1/g2組較g0組含量明顯升高，P＜0.05，g1組較g2組差異明顯，P＜0.05。

3 討論

目前的研究已經(jīng)證實胎兒的腸道是存在細菌的，新生兒出生后腸道菌群的定植與建立是一個復(fù)雜的、連續(xù)演變的一個動態(tài)過程[6-7]。腸道菌群的種類、數(shù)量受多種因素影響，如環(huán)境、胎齡、喂養(yǎng)方式、分娩方式、藥物應(yīng)用等。早產(chǎn)兒腸道有益菌定植較遲，另外早產(chǎn)兒消化系統(tǒng)發(fā)育不成熟，胃腸動力、免疫防御等功能不完善，易患消化道疾病，因此盡早促進腸道有益菌定植，建立正常腸道菌群是尤為重要[8-10]。本研究采用高通量測序方法分析腸道菌群信息，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法及 16S rDNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法不同，高通量測序技術(shù)基于16S rDNA 的微生物群落分析中的要點，在于產(chǎn)生測序覆蓋深度極深的測序數(shù)據(jù)，并通過比對或聚類的分析方法，對數(shù)據(jù)來源的微生物物種進行分析，并估計微生物群落的物種構(gòu)成，進而全面、準確地獲得菌群的信息[11]。本研究檢測了18例早產(chǎn)兒生后1、7、14d大便標本，均能檢測出細菌，但細菌種類及含量總體偏少，隨后日齡增長腸道菌群逐漸發(fā)生變化，出生初期在門水平含量最高的是：變形菌門（Proteobacteria），硬壁菌門（Firmicutes），其次是：類桿菌門（Bacteroidetes），放線菌門（Actinobacteria）。后變形菌門比例出現(xiàn)下降，但仍為優(yōu)勢菌門，伴隨有硬壁菌門及放線菌門含量上升。出生時腸道菌群組成以腸桿菌、鏈球菌、腸球菌、類桿菌等需氧菌或兼性厭氧菌為主，隨后腸桿菌、腸球菌含量逐漸下降，而腸道有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌明顯增加。

微生態(tài)制劑是比較安全的一類藥物，在日本、芬蘭、 意大利等發(fā)達國家，早產(chǎn)兒預(yù)防性使用益生菌制劑已作為常規(guī)治療手段超過10年，迄今為止，在全球范圍內(nèi)沒有微生態(tài)制劑引起嚴重毒副反應(yīng)的報道[12]。雙歧桿菌和乳酸桿菌是人體腸道正常菌群的主要菌種，也是目前微生態(tài)制劑應(yīng)用最多的菌種，在發(fā)酵乳制品中的長期應(yīng)用已經(jīng)被證明了其安全性，極少有報道其潛在的致病性[13-15]。本研究中添加腸道微生態(tài)制劑周期雖短，但能促進腸道有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌生長，且盡早添加微生態(tài)制劑更能促進雙歧桿菌定植。本研究亦有不足之處，添加腸道微生態(tài)制劑時間比較短，雖短期內(nèi)達到預(yù)期效果，但遠期作用未能進一步研究，從新生兒出生至2～3歲腸道菌群種類及數(shù)量才逐步穩(wěn)定，而在此期間，早期短時間添加腸道微生態(tài)制劑是否對后期建立正常腸道菌群有幫助，是否與長期服用微生態(tài)制劑療效一致，需進一步探討。