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    南瓜籽發(fā)芽富集γ-氨基丁酸的培養(yǎng)條件優(yōu)化

    2019-06-14 05:33:56白青云陳敏嫣張化賢趙立
    中國果菜 2019年5期
    關鍵詞:南瓜籽培養(yǎng)液組分

    白青云,陳敏嫣,張化賢,趙立

    (淮陰工學院生命科學與食品工程學院,江蘇淮安223003)

    南瓜籽(Semen Moschatae)是葫蘆科草本植物南瓜的成熟種子,種類豐富,產(chǎn)量巨大。南瓜籽中含有豐富的多不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分,同時富含蛋白質(zhì),其中蛋白質(zhì)含量可達35%以上。南瓜籽還具有一定的保健功能,如降血脂、抗氧化、抗炎、預防前列腺炎等疾病[1]。目前南瓜籽只是作為種子或者簡單的休閑食品,附加值低。南瓜籽是一個活的有機體,在貯藏過程中不斷進行新陳代謝等一系列的生物化學變化[2],在適宜條件下會發(fā)芽變成芽類食品。由于種子在發(fā)芽過程中會提高維生素C、異黃酮等營養(yǎng)成分含量[3,4],芽類食品成為食品界的新寵,研究較多的有發(fā)芽糙米[5]、發(fā)芽大豆[6]、發(fā)芽粟谷[7]和發(fā)芽蠶豆[8]等。目前發(fā)芽糙米已經(jīng)達到了工業(yè)化生產(chǎn)水平[9],而國內(nèi)外對發(fā)芽南瓜籽研究的較少,所研究內(nèi)容也僅限于發(fā)芽過程中南瓜籽生物學特性[10]和亞油酸含量變化[11]等方面。因此,開發(fā)芽類南瓜籽新產(chǎn)品,提高南瓜籽附加值,成為新的研究方向。

    GABAγ-氨基丁酸是生物體內(nèi)廣泛存在的一種非蛋白質(zhì)氨基酸,主要由谷氨酸(Glu)經(jīng)谷氨酸脫羧酶(GAD EC 4.1.1.15)脫羧產(chǎn)生,是哺乳動物大腦抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。研究表明,利用谷物及果蔬中自身存在的谷氨酸脫羧酶,可富集對人體有保健作用的GABA[7,12]。GABA具有降血壓、利尿、鎮(zhèn)靜神經(jīng)、改善失眠以及肝腎功能活化等作用[13]。植物組織中GABA含量很低,不能滿足人體需要,因此提高GABA含量的方法受到廣泛關注。本研究以營養(yǎng)豐富的南瓜籽為原料,采用發(fā)芽法研究南瓜籽富集GABA的工藝條件,優(yōu)化富集GABA的技術參數(shù),為開發(fā)富含GABA的南瓜籽食品提供理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    南瓜籽,淮安市城南農(nóng)貿(mào)市場;GABA標品,購自美國Sigma化學品公司;無水乙醇、冰醋酸、苯酚、次氯酸鈉、氯化鈣(CaCl2)、谷氨酸鈉(MSG)、維生素B6(VB6)等購自國藥化學試劑有限公司,均為分析純。

    1.2 儀器與設備

    TDL-40B型離心機,上海安亭儀器廠;V-1000型可見分光光度計,上海翔藝儀器有限公司;101-1BS型電熱恒溫鼓風干燥箱,上海躍進醫(yī)療器械廠;FK-A組織搗碎勻漿機,江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 南瓜籽發(fā)芽工藝

    稱取一定量的南瓜籽,用1%次氯酸鈉溶液消毒30 min,于25℃去離子水中浸泡6 h,將種子撈出吸去明水,置于墊有四層紗布的培養(yǎng)盤中,均勻鋪開,在一定溫度的培養(yǎng)箱中用配置的培養(yǎng)液浸漬避光培養(yǎng)一定時間,培養(yǎng)結束后取出樣品,測定南瓜籽中GABA含量(鮮重)。

    1.3.2 培養(yǎng)條件對南瓜籽富集GABA的影響

    影響南瓜籽富集GABA的工藝主要有培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)液pH,首先做單因素實驗,設定培養(yǎng)溫度范圍為26~32℃,培養(yǎng)時間為24~84 h,緩沖液pH為4.6~7.0,在單因素實驗的基礎上,采用正交試驗的三因素三水平試驗設計,優(yōu)化南瓜籽富集GABA的最佳發(fā)芽工藝。

    1.3.3 培養(yǎng)液組分對南瓜籽富集GABA的影響

    為進一步提高南瓜籽中GABA含量,在最佳發(fā)芽工藝基礎上,在培養(yǎng)液中添加促進GABA富集的外源添加物MSG、VB6和CaCl2,研究各組分添加量對南瓜籽富集GABA的影響。各組分濃度范圍設定為:MSG 2~10 mg/mL、VB60.1~0.9 mmol/mL、CaCl22.0~10.0 mmol/L。對影響南瓜籽GABA富集的添加物組分采用Box-Behnken design實驗設計進行優(yōu)化,以GABA含量作為考察值,得出南瓜籽富集GABA的最優(yōu)培養(yǎng)液組分。

    1.4 GABA測定方法

    取發(fā)芽的南瓜籽樣品磨碎后,精確稱取1 g樣品于20 mL離心管中,再加入6 mL 7%的乙酸提取1 h后,于4 000 r/min離心10 min,上清液中再加入4 mL無水乙醇沉淀30 min,4 000 r/min離心10 min后,上清液經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮至干,用1 mL蒸餾水溶解后于10 000 r/min離心10 min,上清液用于測定GABA含量。參照白青云等[14]的方法,采用比色法測定樣品中GABA含量。

    1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    試驗設重復3次,結果以x±SD表示,采用設計專家Design expert7.0軟件和SPSS16.0軟件處理試驗數(shù)據(jù),進行方差分析和顯著性檢驗。

    2 結果與討論

    2.1 培養(yǎng)條件對南瓜籽中GABA含量的影響

    2.1.1 培養(yǎng)溫度對南瓜籽中GABA含量的影響

    圖1 培養(yǎng)溫度對南瓜籽中GABA含量的影響Fig.1 Effect of culture temperature on GABA content of pumpkin seed

    圖1顯示了培養(yǎng)溫度對南瓜籽中GABA含量的影響,由圖1可見,在26~32℃范圍內(nèi)南瓜籽用去離子水培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)溫度對南瓜籽中GABA含量有顯著影響,呈先上升后下降的趨勢,30℃時南瓜籽中GABA含量最高,為0.215 mg/g,分別比26℃和32℃提高109.18%和105.27%。由此表明,最適溫度為30℃。

    2.1.2 培養(yǎng)時間對南瓜籽GABA含量的影響

    在溫度30℃、培養(yǎng)液pH5.8的條件下南瓜籽中GABA含量隨培養(yǎng)時間的延長而變化的情況見圖2。從圖2可以看出,隨著培養(yǎng)時間的延長,南瓜籽中GABA含量呈先增加后降低的趨勢,培養(yǎng)48 h含量最高,為0.217 mg/g,是剛開始培養(yǎng)(0 h)的2.94倍。因此,選擇培養(yǎng)48 h為南瓜籽富集GABA的適宜時間。

    圖2 培養(yǎng)時間對南瓜籽中GABA含量的影響Fig.2 Effect of culture time on GABA content of pumpkin seed

    2.1.3 培養(yǎng)液pH對南瓜籽中GABA含量的影響

    在培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時間48 h的條件下,培養(yǎng)液pH對南瓜籽中GABA富集的影響結果見圖3。研究表明,酸性環(huán)境下有利于植物GABA的富集[14]。由圖3可知,pH在4.6~7.0之間,GABA含量隨pH的升高先上升后下降。當pH為5.8時,GABA含量最高,分別是pH4.6和6.4時含量的2.34倍和2.57倍。因此,南瓜籽富集GABA的適合pH為5.8。

    圖3 培養(yǎng)液pH對南瓜籽中GABA含量的影響Fig.3 Effect of culture solution pH on GABA content of pumpkin seed

    2.1.4 正交試驗法優(yōu)化南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)工藝

    在單因素實驗的基礎上,以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)液pH三因素進行正交試驗,優(yōu)化南瓜籽富集GABA的最適培養(yǎng)工藝,試驗設計及結果見表1。

    表1 南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)工藝正交試驗結果Table 1 The results of orthogonal test on germination process of GABA accumulation in pumpkin seed

    由表1的極差分析可知,培養(yǎng)液pH是最主要的影響因素,培養(yǎng)溫度次之,最后是培養(yǎng)時間。南瓜籽富集GABA的最適培養(yǎng)工藝為A3B3C1,即培養(yǎng)溫度32℃、培養(yǎng)時間60 h、培養(yǎng)液pH5.2。在最適培養(yǎng)工藝下,南瓜籽中GABA含量為0.245 mg/g,是原料的3.50倍(南瓜籽原料中GABA含量測定為0.093 mg/g干重,南瓜籽吸水后含水量測定為25.1%)。

    2.2 培養(yǎng)液組分對南瓜籽富集GABA的影響

    2.2.1 CaCl2濃度對南瓜籽中GABA含量的影響

    由圖4可知,隨著CaCl2濃度的增加,南瓜籽GABA含量呈先上升后下降的變化趨勢。當CaCl2濃度為6mmol/L時,GABA富集量最高,為0.290 mg/g,比未添加(最適培養(yǎng)工藝)提高了18.4%。這可能是因為植物中胞質(zhì)Ca2+濃度的增加會刺激GAD活性,從而促進GABA積累[17]。

    2.2.2 MSG添加量對南瓜籽GABA含量的影響

    由圖5可知,隨著培養(yǎng)液中MSG添加量的增加,南瓜籽中GABA含量呈先增長后下降的趨勢。當MSG添加量為 8 mg/mL時,GABA 含量最高(0.308 mg/g),是未添加(最優(yōu)培養(yǎng)工藝下)的1.26倍??赡苁且驗镸SG作為植物GAD的專一底物,可以促進GABA的合成[15]。白青云等[12]關于馬鈴薯的研究也表明,馬鈴薯中添加MSG可以促進GABA的富集,與本研究的結果一致。

    圖4 CaCl2濃度對GABA含量的影響Fig.4 Effects of CaCl2concentration on GABA content

    圖5 MSG濃度對GABA含量的影響Fig.5 Effects of MSG concentration on GABA content

    2.2.3 添加VB6對南瓜籽GABA含量的影響

    圖6 VB6濃度對GABA含量的影響Fig.6 Effects of VB6concentration on GABA content

    培養(yǎng)液中添加VB6對南瓜籽中GABA含量的影響如圖6(見上頁)所示。GABA含量隨VB6添加量的增加先增加后顯著降低,當VB6為0.3 mmol/mL時,GABA含量達到最高。這可能是因為,VB6是GAD的輔基磷酸吡哆醛(PLP)的前體物質(zhì),有激活GAD達到富集GABA的作用。

    2.2.4 南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)液組分優(yōu)化

    在單因素試驗的基礎上,選用三因素三水平的Box-Behnken試驗設計對南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)液組分進行優(yōu)化,試驗方案和相應的實驗結果見表2。

    利用Design Expert軟件,對表2數(shù)據(jù)進行二次多元逐步回歸擬合,得到馬鈴薯富集GABA預測值的二次多項逐步回歸方程:Y=-0.4978+0.2138X1+0.0723X2+0.2032X3+0.0085X1X2-0.0144X1X3+0.0400X2X3-0.0258X12-0.0086X22-0.8669X32。

    對上述回歸模型進行方差分析見表3,結果表明,回歸模型的F=28.27,P=0.0001,模型顯著,其決定系數(shù)R2=0.9732,說明此模型相關性良好,模型具有實踐指導意義。

    表2 南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)液組分優(yōu)化的應面實驗Table 2 Response surface method on components of culture solution for GABA accumulation in pumpkin seed

    表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of Variance(ANOVA) for the regression model

    由表3可見,CaCl2的一次項和二次項對南瓜籽GABA含量有極顯著的影響(P<0.01),MSG的二次項對南瓜籽GABA含量有顯著影響,VB6的一次項和二次項對南瓜籽GABA含量有顯著的影響(P<0.05),其中只有CaCl2和MSG兩者的交互作用對南瓜籽富集GABA的影響顯著(P<0.05)。

    根據(jù)回歸法分析所得二次方程,在試驗設定范圍內(nèi),得到交互作用影響顯著的兩變量之間二次回歸方程的響應曲面圖,見圖7。當VB6濃度為0.3 mmol/mL時,在固定的MSG濃度下,GABA含量隨CaCl2濃度的增加呈先逐漸增加隨后緩慢下降的趨勢。當CaCl2濃度為5.03 mmol/L時,GABA富集量最大。當MSG濃度為7.46 mg/mL,GABA含量最高。MSG是GAD作用的底物,添加適量的MSG可以促進GABA合成,形成有效積累[14]。Ca2+是GAD的激活劑,通過與GAD碳末端的Ca2+/CaM調(diào)節(jié)區(qū)域結合而激活其活性[18],促進GABA富集。研究報道,MSG與CaCl2的聯(lián)合處理可促進馬鈴薯GABA含量的提高[14],本研究結果與此報道結果一致。

    根據(jù)Box-Behnken試驗結果,南瓜籽富集GABA的最佳培養(yǎng)液組分濃度分別為CaCl25.03 mmol/L、MSG 7.46 mg/mL、VB60.28 mmol/mL,在此條件下南瓜籽富集GABA的預測值為0.357 mg/g,驗證試驗得出實測值為0.361 mg/g,說明預測值和實際值之間存在較高的擬合度,所建立的模型是可靠的,可以用來描述組分濃度與響應值之間的關系。以培養(yǎng)液組分最適濃度培養(yǎng)的南瓜籽GABA含量是對照(未添加各組分,0.245 mg/g)的1.47倍,是原料的5.18倍,說明優(yōu)化后的培養(yǎng)液組分能顯著提高南瓜籽中GABA含量。

    圖7 MSG和CaCl2的交互作用對南瓜籽GABA含量影響的響應曲面圖Fig.7 Response plots for the interaction effects of MSG and CaCl2on GABA content of pumpkin seed

    3 結論

    采用正交試驗設計優(yōu)化了南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)工藝,培養(yǎng)液pH、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對南瓜籽GABA富集有顯著影響,三因素的影響順序依次為培養(yǎng)液pH>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時間,最佳的發(fā)芽工藝為培養(yǎng)溫度32℃、培養(yǎng)時間60 h、培養(yǎng)液pH5.2,此時南瓜籽中GABA的富集量為0.245 mg/g,是原料的3.50倍。采用響應面的Box-Benhnken法對南瓜籽富集GABA的培養(yǎng)液組分進行優(yōu)化,南瓜籽GABA富集的最佳組分為CaCl2濃度 5.03 mmol/L、MSG濃度 7.46 mg/mL和 VB6濃度0.28 mmol/mL,在此條件下南瓜籽中GABA含量為0.361 mg/g,是原料的5.18倍。方差分析可知,CaCl2和VB6的一次項、CaCl2和MSG的交互作用均顯著影響南瓜籽中GABA含量。

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