高效液相色譜法測定花生仁中甲咪唑煙酸殘留

黃志勇 ，李汶鮮 ，陳艷 ，鄒沫君 ，景贊 ，劉超

（1.四川省樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，四川樂山614000；2.四川省樂山市沙灣區(qū)綏山初級中學(xué)，四川沙灣614900）

隨著除草劑范轉(zhuǎn)及使用量的增大，其在農(nóng)作物中的殘留，以及對人類健康和環(huán)境造成的毒害，也越來越被人們所關(guān)注[1,2]。甲咪唑煙酸（Imazapic）是一種咪唑啉酮類花生專用除草劑[3]。該類除草劑由于淋溶性強(qiáng)，易污染地下水，同時(shí)在土壤中殘留時(shí)間較長，容易對后茬作物造成傷害[4,5]。我國對甲咪唑煙酸在部分農(nóng)產(chǎn)品中的殘留做出了嚴(yán)格的限量要求[6]。

目前針對花生仁中甲咪唑煙酸農(nóng)藥殘留定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法是在GB 2763-2016標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的參照GB 23200.13-2016的方法，該方法采用的是液相色譜-質(zhì)譜測定茶葉中的多種農(nóng)藥殘留[7]?；ㄉ驶|(zhì)因含有大量的油脂和蛋白質(zhì)，因此與測定茶葉基質(zhì)的方法有顯著的區(qū)別，而且該方法僅僅是對甲咪唑煙酸的定性檢測，標(biāo)準(zhǔn)峰出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的肩峰。本試驗(yàn)在前人工作的基礎(chǔ)上[8,9]，根據(jù)花生仁樣品和甲咪唑煙酸性質(zhì)結(jié)合文獻(xiàn)資料分析[10]，建立了以乙腈：0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（加入0.1%的三乙胺，磷酸調(diào)pH3.0）體積比1：3作為流動(dòng)相，采用實(shí)驗(yàn)室普及率較高的高效液相色譜（紫外檢測器）定量檢測其殘留量。該方法操作簡便、分離度好、結(jié)果準(zhǔn)確，能很好地應(yīng)用在對花生仁中甲咪唑煙酸殘留量的定量檢測上。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲咪唑煙酸（98.5%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈，色譜純，北京北靈威科技有限公司；正己烷（色譜純），成都市科龍化工試劑廠；三乙胺，色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鈉，分析純，成都市科龍華試劑廠；磷酸二氫鉀、磷酸，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

小型高速粉碎機(jī)，永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；CP225D電子天平，德國賽多利斯公司；TG-16臺式高速離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；組織搗碎勻漿儀，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；UPT-Ⅱ-10T超純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司；多參數(shù)測試儀，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；EV331旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，萊伯泰科有限公司；島津LC-20A高效液相色譜儀（配SPD-20A紫外檢測器），日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以甲醇為溶劑，配置濃度分別為 0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mg/L的甲咪唑煙酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。經(jīng)0.22 μm的有機(jī)微孔膜過濾，再進(jìn)行HPLC分析，以甲咪唑煙酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取15 g勻漿后的花生仁樣品于50 mL具塞離心管中，加入5 g無水硫酸鈉、20 mL乙腈，在高速組織搗碎機(jī)上以15 000 r/min勻漿提取1 min，4 000 r/min離心5 min，上清液移入50 mL具塞離心管中。殘?jiān)偌?0 mL乙腈重復(fù)提取1次，上清液并入50 mL具塞離心管中。向其中加入5 mL乙腈飽和的正己烷溶液，劇烈振搖1 min，靜置分層，棄去上層正己烷溶液，取30 mL乙腈溶液于雞心瓶中，50℃水浴，旋轉(zhuǎn)濃縮至干，加入20%甲醇水溶液2 mL溶解，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，進(jìn)行HPLC分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：Thermo C18不銹鋼柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液，其中加入0.1%的三乙胺，磷酸調(diào)pH 3.0，A、B的體積比為 1：3；等度洗脫，流速為 0.8 mL/min；柱溫 25 ℃；進(jìn)樣體積5 μL；檢測波長280 nm；外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相的組成成分各自的性質(zhì)和濃度對目標(biāo)物的色譜峰型和分離存在密切的關(guān)系。按照GB/T 23200.13-2006標(biāo)準(zhǔn)使用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為混合流動(dòng)相時(shí)，按照1.4色譜條件進(jìn)行分析，標(biāo)準(zhǔn)峰出現(xiàn)與上述國標(biāo)類似的峰型較寬且存在不對稱的情況。為此，根據(jù)甲咪唑煙酸結(jié)構(gòu)特點(diǎn)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，采用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（加入0.1%的三乙胺，磷酸調(diào)pH3.0）體積比1：3作為改良流動(dòng)相進(jìn)行分析，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)峰型對稱、峰寬較窄，如圖1所示。

圖1 甲咪唑煙酸對照品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of imazapic standard

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照1.4色譜條件對甲咪唑煙酸標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)峰面積（A）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度C（mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并作線性回歸。得到的線性方程為A=9091.4C-47.816，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。在該法條件下甲咪唑煙酸的最小檢出量為0.2 ng，方法檢測限為 7 μg/kg。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 重復(fù)性

以甲咪唑煙酸對照品加標(biāo)濃度為0.1 mg/kg的陰性樣品作為供試品溶液，平行制備6份，按照1.3.2的樣品前處理，1.4色譜條件測定每份供試品的含量，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算得甲咪唑煙酸的含量分別為0.098 3、0.098 5、0.097 7、0.098 6、0.099 1、0.098 1 mg/kg，RSD為0.49%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.3.2 精密度

以甲咪唑煙酸濃度為0.01 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液做精密度測試，按照1.4色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積分別為 406、394、407、396、397、407，RSD 為 1.6%，說明該方法精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性

以甲咪唑煙酸對照品加標(biāo)濃度為0.1 mg/kg的陰性樣品作為供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12 h后按照1.3.2處理，1.4色譜條件測定不同穩(wěn)定時(shí)間供試品溶液中甲咪唑煙酸的含量分別為0.098 5、0.098 6、0.098 4、0.097 8、0.097 4 mg/kg，RSD為0.53%，說明該方法在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱取未檢出甲咪唑煙酸的陰性花生仁樣品18份，將其分成3組，添加相當(dāng)于樣品含甲咪唑煙酸濃度分別為0.45、0.9、1.8 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本法進(jìn)行提取、凈化處理，分別做6次平行實(shí)驗(yàn)。對比陰性樣品色譜圖標(biāo)準(zhǔn)峰與雜質(zhì)峰實(shí)現(xiàn)了很好的分離。各添加質(zhì)量濃度平均回收率結(jié)果見表1所示，平均回收率在91.1%～98.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.43%～0.63%。結(jié)果表明該方法的回收率能滿足測定要求。

表1 各添加量的平均回收率結(jié)果和RSD（n=6）Table 1 Addition standard recovery and RSD（n=6）

2.4 樣品的檢測

用上述方法測定了隨機(jī)從當(dāng)?shù)爻匈徺I的不同產(chǎn)地的花生仁樣品10份，均未檢出甲咪唑煙酸殘留。

3 結(jié)論

建立了一種簡便的高效液相色譜法檢測花生仁中甲咪唑煙酸的方法。本方法對GB/T23200采用的乙腈-0.1%甲酸水溶液流動(dòng)相進(jìn)行了探討，確定了乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（加入0.1%的三乙胺，磷酸調(diào)pH為3.0）（體積比1：3）作為新流動(dòng)相，實(shí)現(xiàn)了對標(biāo)準(zhǔn)峰型的優(yōu)化和與雜質(zhì)峰的分離。結(jié)果表明，甲咪唑煙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在0～1.2 mg/L范圍內(nèi)線性良好（R2=0.9999），檢出限為7 μg/kg。經(jīng)過方法學(xué)的考察，其重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性較好，并且在花生仁中甲咪唑煙酸標(biāo)準(zhǔn)限值（0.1 mg/kg）附近添加三個(gè)不同濃度分別為0.045、0.09、0.18 mg/kg，獲得了 91.1%～98.9%的回收率，RSD為 0.43%～0.63%，適用于花生仁中甲咪唑煙酸殘留量的定量檢測。